Negli ultimi anni, con il rapido sviluppo della biomedicina, l'emergere di terapie cellulari e geniche durante la pandemia di COVID-19 e l'avvento dei vaccini a mRNA, garantire la sicurezza e l'affidabilità dei prodotti biologici è diventato un punto focale per governi e organismi di regolamentazione in tutto il mondo. La contaminazione da micoplasma è un tipo di contaminazione comune ma solitamente difficile da eliminare. I requisiti normativi impongono la "garanzia di nessuna contaminazione da micoplasma" per i bioprocessi che coinvolgono la coltura cellulare.
Requisiti delle agenzie di regolamentazione per i test sul micoplasma:
- Le "Linee guida per l'industria: caratterizzazione e qualificazione di substrati cellulari e altri materiali biologici utilizzati nella produzione di vaccini virali per indicazioni di malattie infettive" della FDA stabiliscono il controllo del micoplasma per materie prime, semi virali e fluidi di raccolta non trattati.
- L'edizione 2020 della Farmacopea cinese, parte III, "Preparazione e controllo di qualità dei substrati di cellule animali utilizzati per i test di produzione di prodotti biologici" richiede test sul micoplasma per le cellule di produzione, tra cui le banche cellulari master (MCB), le banche cellulari di lavoro (WCB) e le cellule di fine produzione (EOPC).
- Le "Linee guida tecniche per la ricerca farmaceutica e la valutazione di prodotti per la terapia cellulare immunitaria (sperimentazione)" raccomandano di condurre test correlati alla sicurezza del micoplasma su campioni intermedi idonei in momenti chiave o di implementare misure pertinenti per il controllo. Il test del micoplasma è richiesto anche come test di rilascio per i prodotti finali.
Test degli acidi nucleici (NAT) e metodi tradizionali:
Prima dell'avvento di metodi di rilevamento rapido come la tecnologia di amplificazione degli acidi nucleici (NAT), venivano impiegati metodi di coltura tradizionali e saggi di cellule indicatrici. Tuttavia, a causa di lunghi cicli di rilevamento o problemi di sensibilità, questi metodi spesso prolungavano i cicli di produzione o rilascio o richiedevano il rilascio condizionale di materiali cellulari in base alla valutazione del rischio o all'esplorazione di metodi alternativi. Con l'avanzamento delle terapie cellulari e geniche, c'è una crescente domanda nel settore di metodi di rilevamento del micoplasma con maggiore tempestività e sensibilità. La breve durata di conservazione dei prodotti non può sostenere lunghi periodi di test, quindi i metodi NAT sono emersi come alternative favorevoli.
Attualmente, la Farmacopea Europea (EP) <2.6.7>, la Farmacopea Giapponese (JP) e la Farmacopea degli Stati Uniti (USP) <63> hanno tutte incluso i metodi NAT come metodi di rilevamento del micoplasma. Tuttavia, la convalida di questo metodo e il confronto con i metodi tradizionali per garantire che la sua sensibilità non sia inferiore sono prerequisiti per il suo utilizzo. Sebbene l'edizione del 2020 della Farmacopea Cinese (ChP) non abbia incluso NAT come metodo di rilevamento del micoplasma, menziona la possibilità di utilizzare "altri metodi riconosciuti dall'autorità nazionale di regolamentazione dei farmaci". A maggio 2022, il Drug Review Center della National Medical Products Administration (NMPA) ha pubblicato le "Linee guida tecniche per la ricerca farmaceutica e la valutazione dei prodotti per la terapia cellulare immunitaria (sperimentazione)", che suggeriscono di prendere in considerazione lo sviluppo di nuovi metodi di rilevamento sterili e del micoplasma per i test di rilascio in circostanze speciali quando il volume del campione è limitato o è necessario un rilascio rapido e i metodi farmacopeici sono inadeguati. Pertanto, si prevede che i metodi NAT saranno sempre più utilizzati da un numero maggiore di fornitori di materie prime e di aziende produttrici di medicinali per terapie avanzate (ATMP) come metodo in grado di supportare test di rilascio rapido del micoplasma.
Metodo NAT - Requisiti di convalida del metodo
Il processo di convalida per i metodi NAT è descritto in dettaglio nella Farmacopea Europea <2.6.7> e la Farmacopea giapponese, con contenuti sostanzialmente coerenti. Il National Institutes for Food and Drug Control (NIFDC) ha anche pubblicato un articolo intitolato "Considerations on Nucleic Acid Detection Methods and Methodological Validation for Mycoplasma Examination", con l'obiettivo di fornire una guida per sviluppatori e utenti di metodi di amplificazione degli acidi nucleici del micoplasma in Cina. Specificità, limite di rilevamento e robustezza sono essenziali per convalidare i metodi NAT del micoplasma. Se vengono utilizzati kit commerciali per la rilevazione del micoplasma, la convalida dell'idoneità del metodo può essere condotta in base al rapporto completo sulle prestazioni del kit del fornitore, combinato con l'ambiente di laboratorio e il tipo di campione.
Specificità:
La specificità si riferisce alla capacità di un metodo analitico di determinare accuratamente l'analita in presenza di altri componenti (come impurità, prodotti di degradazione, eccipienti, ecc.). L'EP sottolinea la necessità di concentrarsi sulle reazioni incrociate tra altre specie batteriche strettamente correlate all'albero filogenetico, come Clostridium, Lactobacillus e Streptococcus all'interno dei batteri Gram-positivi. Si dovrebbe anche prestare attenzione ai tipi di contaminanti comuni come la contaminazione del DNA umano nelle cellule ospiti e negli ambienti sperimentali.
Limite di rilevamento:
Il limite di rilevamento è la quantità minima di analita che può essere rilevata in un campione. Serve come base di identificazione qualitativa e non deve essere quantificato come valore esatto. L'EP richiede 24 punti dati di rilevamento per ogni specie di micoplasma a ogni concentrazione di diluizione. Ciò può essere ottenuto eseguendo tre diluizioni seriali indipendenti da 10 volte in giorni diversi, con otto rilevazioni ripetute per ogni gradiente di diluizione, oppure eseguendo quattro diluizioni seriali indipendenti da 10 volte in giorni diversi, con sei rilevazioni ripetute per ogni gradiente di diluizione. Un tasso di positività di rilevamento superiore al 95% può essere considerato come limite di rilevamento. Per i tipi di micoplasma che richiedono la conferma del limite di rilevamento, i produttori di kit devono coprire quanti più tipi di micoplasma possibile come richiesto dalle farmacopee normative ed esplorare i limiti di rilevamento per ogni tipo di micoplasma. Per le aziende biofarmaceutiche, è consigliabile considerare anche i tipi di micoplasma umano.
- Se durante il processo di produzione vengono utilizzate o riscontrate cellule o materiali aviari, è necessario effettuare la verifica del limite di rilevamento per Mycoplasma synoviae.
- Se durante il processo di produzione vengono utilizzati o riscontrati materiali contenenti insetti o piante, è necessario effettuare la verifica del limite di rilevamento per l'Acholeplasma.
- Il micoplasma nasale suino è altamente diffuso nei campioni contaminati da micoplasma e ha attirato l'attenzione del China Institute for Food and Drug Control.
Rispetto alla Farmacopea europea, la Farmacopea giapponese non menziona il micoplasma aviario per il quale è richiesta la verifica del limite di rilevamento, ma include il micoplasma salivare.
Robustezza:
La robustezza si riferisce alla capacità di un metodo di resistere a piccole variazioni nelle condizioni di misurazione senza esserne influenzato, fornendo una base per l'uso del metodo stabilito nei test di routine. La valutazione della robustezza dovrebbe concentrarsi sulla tolleranza dei metodi di rilevamento del micoplasma alle variazioni nella concentrazione di MgCl2, primer e dNTP nei reagenti di rilevamento, modifiche nei kit di estrazione degli acidi nucleici o nelle fasi di estrazione e l'uso di diversi amplificatori degli acidi nucleici.
Studio di comparabilità
Se si vuole utilizzare il NAT come sostituto dei metodi farmacopeici, è necessario confermare tramite confronto che il NAT può sostituire i metodi basati sulla coltura o i metodi di coltura cellulare indicatrice.Ciò comporta in genere la considerazione del limite di rilevamento del metodo, nonché della specificità (come l'intervallo di copertura del micoplasma e possibili falsi positivi). Per confrontare i limiti di rilevamento, dovrebbe soddisfare il criterio che "un limite di rilevamento di 10 CFU/mL può sostituire i metodi basati sulla coltura e un limite di rilevamento di 100 CFU/mL può sostituire i metodi di coltura cellulare indicatrice".
Esistono due approcci opzionali per condurre studi di comparabilità:
- Condurre esperimenti sincroni utilizzando gli stessi ceppi di micoplasma convalidati sia per i metodi NAT che per quelli farmacopeici per confermare il limite di rilevamento.
- Confrontando i risultati della convalida NAT con i risultati della convalida dei metodi farmacopeici precedenti, è richiesta un'attenta documentazione dei file di conferma per gli standard di micoplasma utilizzati in entrambi i metodi.
Rilevamento qPCR del Mycoplasma NAT - Soluzione completa
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Il kit di test qPCR Mycoplasma Yeasen MycAway™ (metodo sonda) è un prodotto di rilevamento qualitativo rapido basato su NAT (tecniche di amplificazione degli acidi nucleici) per la potenziale contaminazione da micoplasma in materie prime, banche cellulari, semi virali, fluidi di raccolta di virus o cellule e cellule terapeutiche. Questo kit, basato sulla tecnologia PCR quantitativa, utilizza sonde a fluorescenza Taqman per rilevare qualitativamente il DNA del micoplasma nel campione di test, coprendo oltre 160 sequenze di DNA del micoplasma. Segue rigorosamente le linee guida e i requisiti di EP 2.6.7 e JP G3 per il rilevamento del micoplasma, dimostrando elevata sensibilità, buona specificità e sicurezza. Può essere utilizzato insieme al kit di pretrattamento del campione di DNA residuo con perline magnetiche MolPure® per estrarre manualmente i campioni o estrarre automaticamente gli acidi nucleici utilizzando l'estrattore di acidi nucleici completamente automatico Auto-Pure 32A. Dopo il pretrattamento del campione per rimuovere le impurità interferenti e ottenere il DNA del micoplasma purificato, il segnale di fluorescenza della sonda viene raccolto tramite qPCR per determinare il risultato del rilevamento.
Servizi Tecnici
- Fornitura di report di convalida completi per il kit di test qPCR MycAway™ Mycoplasma.
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| Descrizione | Numero di parte |
| Kit di preparazione del campione di DNA residuo magnetico MolPure® | 18461ES |
| Kit di rilevamento qPCR MycAway™ Mycoplasma (2G) | 40619ES |