Escherichia coli Kit di rilevamento dei residui di DNA delle cellule ospiti (2G)
Riepilogo delle qualifiche (Cat. n.: 41308(ES60)
- Sfondo
I dati riassunti in questo rapporto sono stati eseguiti da Yeasen Biotechnology per il prodotto 'E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit (2G). I dati riassuntivi sono solo per riferimento dell'utente, e l'utente deve verificare il residuo della cellula ospite Metodo del DNA utilizzando i propri campioni per confermare che il metodo può soddisfare i requisiti dell'utente. Si raccomanda a tutti i laboratori che utilizzano questo kit di verificare i seguenti parametri: Linearità, Range, Accuratezza, Precisione, Limite di quantificazione, Specificità e Robustezza.
Yeasen Biotechnology può fornire il report di qualificazione dettagliato per questo kit. Se l'utente utilizza questo report, solo l'idoneità (che includeva Precisione, Precisione e Specificità) devono essere verificate.
- Materiali e metodi sperimentali
2.1 Kit di rilevamento dei residui di DNA delle cellule ospiti di E. coli (2G), fornitore: Yeasen, n. cat.: 41308ES60.
2.2 Kit di preparazione del campione di DNA residuo magnetico MolPure®, fornitore: Yeasen, n. cat.: 18461ES60.
2.3 Standard nazionale per il contenuto di DNA di E. coli: Cat. 270027, Lotto n.: 201101, concentrazione: 96,2 μg/mL, condizioni di conservazione: -70℃, acquistato da: National Institutes for Food and Drug Control.
2.4 Dati originali: la versione elettronica è stata registrata nel 'Rapporto sperimentale' il sottofile del file padre 'E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit (2G)'.
2.5 Metodi: I materiali e i metodi operativi utilizzati per l'esperimento sono stati fondamentalmente prodotti o stabiliti da Yeasen Biotechnology, valutati e verificati a lungo; lo sviluppo e la produzione del kit hanno seguito il sistema ISO 13485.
- Contenuti e risultati della qualificazione
3.1 Campo di rilevamento
L'intervallo lineare del kit era 30 fg/μL~300 pg/μL con R2=1 e l'efficienza di amplificazione è stata del 101,74% con CV<15% per ogni analisi di concentrazione.
Figura 1 Curva standard qPCR del DNA di E.coli (2G)
3.2 Precisione
3.2.1 Deviazione da Standard nazionale per il contenuto di DNA di E. coli
Il materiale di riferimento del DNA di E. coli in ogni lotto del kit è stato calibrato utilizzando lo standard nazionale per il contenuto di DNA di E. coli. Il materiale di riferimento del DNA di Yeasen era sostanzialmente privo di deviazioni dallo standard nazionale per il contenuto di DNA di E. coli curva di calibrazione e la deviazione del valore del test era <5%.
3.2.2 Rrecupero
3.2.2.1 Esperimento di recupero del picco del campione vuoto
Sono stati preparati campioni di standard di DNA di E. coli ad alte e basse concentrazioni: rispettivamente 300 pg/μL, 3 pg/μL e 30 fg/μL e analizzati dopo l'estrazione utilizzando il kit di pretrattamento dei campioni di DNA residuo con metodo a perline magnetiche (sono state eseguite 2 repliche di estrazione per ciascun campione e 3 repliche di analisi per ciascuna estrazione), e sono stati analizzati i recuperi dei campioni e i CV.
Per diverse concentrazioni di campioni di DNA, i recuperi variavano dal 70% al 130% e i CV erano tutti <20%.
| Tipo di campione | Concentrazione teorica | Estrarre 1 media | Estrarre 2 significa | Concentrazione media | Curriculum Vitae | Recupero |
| Campione vuoto | / | / | / | / | / | / |
| Campione di recupero 1 | 300 pg/μL | 250,56 pg/μl | 262.11 pg/μl | 256,33 pg/μl | 4,41% | 85,44% |
| Campione di recupero 2 | 3 pg/μL | 2.29 pg/μl | 2.56 pg/μl | 2.42 pg/μl | 7,09% | 80,77% |
| Campione di recupero 3 | 30 fg/μL | 33.62 fg/μl | 32.61 fg/μl | 33.12 fg/μl | 14,28% | 110,39% |
Tabella 1 Recupero del campione vuoto Spiking
3.2.2.2 Esperimento di recupero del picco del campione simulato
Sono stati estratti campioni della stessa concentrazione (3 pg/μL di DNA di E. coli) (sono state eseguite 2 repliche di estrazione per ciascun campione e 3 repliche di analisi per ciascuna estrazione) con 5 diverse soluzioni di base (ad alto contenuto proteico, ad alto contenuto di acidi nucleici, ad alto e basso pH, ad alto contenuto di sale) e sono stati analizzati i recuperi dei campioni e i CV.
I recuperi dei campioni di DNA per diverse soluzioni di base variavano dal 70% al 130%, con tutti i CV <20%.
| Tipo di campione | Concentrazione teorica | Estrarre 1 media | Estrarre 2 significa | Concentrazione media | Curriculum Vitae | Recupero |
| Esempio di base | / | / | / | / | / | / |
| Alto contenuto proteico | 3 pg/μL | 2.25 | 2.23 | 2.24 | 1,09% | 74,74% |
| Acido nucleare alto | 3.93 | 3,96 | 3,95 | 1,56% | 131,52% | |
| Ad alto contenuto di sale | 2.69 | 2.67 | 2.68 | 2.63 | 89,20% | |
| pH elevato | 2,90 | 3.67 | 3.29 | 13,82% | 109,55% | |
| pH basso | 2.77 | 2.87 | 2.82 | 3,41% | 94,01% |
Tabella 2 Recupero del campione di base Spiking
3.3 Precision
3.3.1 Ripetibilità
Ripetere il test 10 volte per gli standard di DNA di E. coli a una concentrazione di 3 pg/μL con un CV <15%.
| Ripetizioni | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | Significare | Curriculum Vitae |
| Valore di rilevamento (fg/μL) | 3.16 | 2.87 | 2.97 | 2.86 | 2.81 | 2.97 | 3.14 | 3.21 | 3.14 | 3.1 | 3.02 | 4,78% |
Tabella 3 Risultati di ripetibilità
3.3.2 Precisione intermedia
Tre sperimentatori hanno testato in modo indipendente campioni standard di DNA di E. coli ad alte e basse concentrazioni: 300 pg/μL, 3 pg/μL e 30 fg/μL; sono state eseguite tre repliche per ciascuna concentrazione e i CV di tutti i nove dati ottenuti erano <15%.
| Esp |
Concentrazione effettiva Concentrazione teorica | DNA di Escherichia coli (2G) | ||
| 300 pg/ul | 3 pg/ul | 30 fg/ul | ||
| Esp 1 | Determinazione 1 | 295,65 | 3.22 | 26,90 |
| Determinazione 2 | 287.71 | 3.24 | 32,00 | |
| Determinazione 3 | 300,23 | 3.17 | 27.50 | |
| Esp 2 | Determinazione 4 | 306.06 | 3.13 | 37.30 |
| Determinazione 5 | 299,76 | 3.02 | 32,70 | |
| Determinazione 6 | 299.63 | 3.02 | 34,00 | |
| Esp 3 | Determinazione 7 | 266,70 | 3.01 | 35,90 |
| Determinazione 8 | 272,89 | 3.09 | 40,70 | |
| Determinazione 9 | 276,51 | 3.01 | 35.20 | |
| / | Significare | 289,46 | 3.10 | 33,60 |
| / | Curriculum Vitae | 4,89% | 3,02% | 13,18% |
Tabella 4 Risultati di precisione intermedia
3.4 Specificità
L'interferenza del DNA genomico cellulare comunemente utilizzato nella produzione di prodotti biologici è stata valutata per l'interferenza con i reagenti di rilevamento del DNA di E. coli; il gruppo di interferenza si è sovrapposto al gruppo di controllo e non è stata osservata alcuna interferenza (la figura seguente mostra, in ordine, i dati di interferenza dei DNA genomici HEK293, Vero e CHO con i reagenti di rilevamento del DNA di E. coli).
Figura 2 Risultati dell'esperimento di interferenza
3.5 Limite di quantificazione
Il DNA di E. coli è stato rilevato a 50 fg/μL, 40 fg/μL, 30 fg/μL, 10 fg/μL e 5 fg/μL, con 10 repliche per ciascuna concentrazione. I risultati hanno mostrato che il CV era <20% a concentrazioni di 30 fg/μL e superiori. Vale a dire, il limite di quantificazione del kit di rilevamento dei residui di DNA delle cellule ospiti di E. coli (2G) era di 30 fg/μL.
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Ripetizioni Elemento di prova | DNA di Escherichia coli (2G) (fg/μL) | |
| Quantità | Rapporto di ricalcolo | |
| 1 | 29.43 | 98,09% |
| 2 | 29.51 | 98,35% |
| 3 | 32.04 | 106,79% |
| 4 | 26.07 | 86,89% |
| 5 | 34.06 | 113,53% |
| 6 | 33.54 | 111,79% |
| 7 | 26,95 | 89,82% |
| 8 | 27.38 | 91,26% |
| 9 | 27.04 | 90,13% |
| 10 | 26.10 | 87,02% |
| Significare | 29.21 | / |
| Curriculum Vitae | 10,40% | / |
Figura 3 Risultato del test qPCR del DNA di E. coli (2G) da 30 fg/μL
3.6 Robustezza
Questo kit è stato testato ed è adatto, ma non limitato a, i seguenti strumenti:
| Venditore | Modelli di strumenti | Efficienza di amplificazione | R2 | Limite di quantificazione (fg/μL) | Curriculum Vitae |
| Termo | ABI 7500 | 101,74% | 1 | 30 | 13,30% |
| Termo | ABI QuantStudio5 | 100,46% | 1 | 30 | 12,40% |
| Bio-Rad | CFX96 | 99,20% | 0,999 | 30 | 13,76% |
| Shanghai Hong-Shi | SLAN | 100,40% | 0,999 | 30 | 11,67% |
Tabella 5 Risultati dei test di idoneità dello strumento
3.7 Stabilità
3.7.1 Stabilità al gelo e allo scongelamento
Il kit di rilevamento dei residui di DNA delle cellule ospiti di E. coli (2G) è stato testato mediante ripetuti congelamenti e scongelamenti per 10 volte e le prestazioni del kit non sono state compromesse.
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Indicatori di prova Tempi di congelamento e scongelamento | Parametro | Tempo T0 | Congelare e scongelare 10 volte |
| Parametro della curva standard | Efficienza di amplificazione | 98,23% | 100,20% |
| R2 | 1 | 0,999 | |
| Limite di quantificazione (30 fg/μL) | Curriculum Vitae | 15,07% | 9,66% |
Tabella 6 Analisi dei risultati della stabilità al congelamento-scongelamento
3.7.2 Stabilità accelerata
E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit (2G) sono stati conservati a 2~8°C per 30 giorni e a 37°C per 14 giorni, rispettivamente. Nessuna delle prestazioni del kit è stata influenzata.
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Indicatori di prova Temperatura e tempo di accelerazione | Parametro | Esperimento 1 | Esperimento 2 | ||
| Tempo T0 | 2~8℃ 30 Giorni | Tempo T0 | 37℃ 14 giorni | ||
| Parametro della curva standard | Efficienza di amplificazione | 97,77% | 99,81% | 98,39% | 98,65% |
| R2 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| Limite di quantificazione (30 fg/μL) | Curriculum Vitae | 11,04% | 13,79% | 9,55% | 14,55% |
Tabella 7 Analisi accelerata dei risultati di stabilità
- 4.Riferimento
4.1 Commissione per la farmacopea cinese (ChPC). Farmacopea della Repubblica Popolare Cinese (Vol Ⅲ) [S]. Pechino: China Medical Science and Technology Press, p.542-543, 2020.
4.2 NMPA, 2007: Principi generali per la revisione tecnica della convalida del metodo analitico per il controllo di qualità dei prodotti biologici.
4.3 ICH(2022)《Validazione del metodo analitico Q2》, versione bozza.
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