La PCR diretta è una reazione che utilizza direttamente sangue, tessuti animali o vegetali, ecc., per l'amplificazione senza passaggi per l'estrazione e la purificazione dell'acido nucleico. Porta una praticità senza precedenti all'amplificazione del DNA, che può far risparmiare molto tempo. Quindi quali sono i reagenti e i prodotti utilizzati nella PCR diretta?

1. Che cosa è la PCR diretta
2. Quali reagenti sono necessari per la PCR diretta
3. Scenari applicativi e caratteristiche del Direct PCR Kit
4. Dati del prodotto
5. Feedback del cliente
6. Informazioni sull'ordinazione del prodotto

1. Che cosa è la PCR diretta

Dopo un continuo ampliamento e miglioramento da parte di innumerevoli studiosi in tutto il mondo, la tecnologia PCR è diventata il metodo di ricerca di base più ampiamente utilizzato, più frequentemente utilizzato e più importante nell'intero campo delle scienze della vita. Touch Down PCR, RT-PCR, Real-Time PCR, Multi PCR, ecc. sviluppati sulla base dell'ampia applicazione della tradizionale tecnologia PCR, così come l'ultima PCR digitale (Digital PCR), hanno notevolmente arricchito la ricerca della maggior parte dei ricercatori scientifici. Questi metodi hanno notevolmente accelerato lo sviluppo delle moderne scienze della vita, in particolare della biologia molecolare, e hanno apportato grandi contributi alla ricerca della vita e della natura per l'intero essere umano. La tradizionale tecnologia PCR e varie nuove tecnologie e nuove applicazioni da essa derivate hanno un prerequisito, ovvero devono essere ottenuti in anticipo modelli di acido nucleico ad alta purezza. Qualsiasi campione biologico deve passare attraverso una serie di complesse e noiose elaborazioni del campione per ottenere campioni di acido nucleico che soddisfino i requisiti tecnici della PCR. La separazione e l'estrazione di DNA e RNA sono sempre state il lavoro di base che il personale scientifico e tecnico pertinente deve ripetere ogni giorno. A causa dell'enorme differenza tra i campioni, anche il processo di separazione ed estrazione di DNA e RNA è molto diverso. Questo lavoro richiede un elevato livello di competenza tecnica per gli operatori. A causa dell'uso di alcuni reagenti chimici altamente tossici nella tradizionale tecnologia di separazione ed estrazione, l'esposizione a lungo termine causerà danni irreversibili al corpo dell'operatore e causerà persino danni diretti durante l'esperimento. Reagenti chimici come fenolo e cloroformio sono importanti cancerogeni in laboratorio e l'azoto liquido utilizzato nel processo di separazione degli acidi nucleici ed estrazione dei tessuti vegetali rappresenta una minaccia maggiore per la sicurezza degli operatori durante l'esperimento a causa della sua temperatura estremamente bassa. Allo stesso tempo, per coloro che hanno un gran numero di campioni da studiare, separare ed estrarre gli acidi nucleici è un compito che richiede molto lavoro. Ora i kit di isolamento ed estrazione degli acidi nucleici sul mercato sono maturi e ci sono molti marchi, ma sono tutti più o meno uguali. Che si tratti di un kit centrifugo con colonna a membrana di silice o di un kit con metodo a sfere magnetiche, è richiesto molto tempo e il costo è elevato. Oltre al costo del kit, ci sono requisiti speciali per le attrezzature di laboratorio. La postazione di lavoro automatizzata utilizzata nel metodo delle biglie magnetiche è un'attrezzatura di grande valore su larga scala molto tipica, che rappresenta una spesa enorme per il laboratorio. Per riassumere, prima di eseguire esperimenti PCR, il pretrattamento del campione è un mal di testa inevitabile e costante per i ricercatori. Come risolvere questo problema ed eseguire direttamente esperimenti PCR senza separazione ed estrazione di acidi nucleici è sempre stato un problema a cui hanno pensato molti ricercatori scientifici e personale di laboratorio clinico.

La PCR diretta è una reazione in cui i tessuti animali o vegetali vengono utilizzati direttamente per l'amplificazione senza estrazione di acidi nucleici. Per molti versi, la PCR diretta funziona come la PCR convenzionale.La differenza principale è il buffer personalizzato utilizzato nella PCR diretta. Il campione può essere sottoposto direttamente alla reazione PCR senza estrazione di acido nucleico, ma ci sono requisiti corrispondenti per la tolleranza degli enzimi coinvolti nella reazione PCR diretta e la compatibilità del buffer. Sebbene ci siano più o meno inibitori della PCR nei campioni comuni, la PCR diretta può comunque ottenere un'amplificazione affidabile sotto l'azione di enzimi e buffer. Tuttavia, la reazione PCR tradizionale deve utilizzare acido nucleico di alta qualità come stampo per la reazione. Se lo stampo contiene proteine ​​e altre impurità, inibirà il regolare svolgimento della reazione PCR.

Il primo campo di applicazione della PCR diretta è il campo degli animali e delle piante, come sangue, tessuti e peli di topi, gatti, polli, conigli, pecore, bovini e altri animali; foglie e semi di piante, ecc. Viene utilizzata per studiare la genotipizzazione, la transgenicità, il rilevamento di plasmidi, l'analisi del gene knockout, l'identificazione della fonte del DNA, l'identificazione delle specie, l'analisi SNP e altri campi. Questi campi hanno alcune caratteristiche comuni, ovvero il contenuto del gene bersaglio è relativamente alto e l'estrazione dell'acido nucleico è problematica. Pertanto, la PCR diretta può non solo far risparmiare tempo e avere un impatto minimo sui risultati, ma anche far risparmiare sui costi.

2. Quali reagenti sono necessari per la PCR diretta

2.1 Campione di lisato

Il campione di lisato può essere preparato da soli o acquistato. La differenza nei componenti di diverse marche di lisato causerà una diversa capacità di lisi e quindi il tempo di lisi sarà leggermente diverso. Ad esempio, per la preparazione di campioni di tessuto animale, si consiglia generalmente di lisare per 30 minuti o durante la notte e il lisato per i virus varia da 3 a 10 minuti.

2.2 Master mix PCR

Si raccomanda di utilizzare una DNA polimerasi hot-start per migliorare l'amplificazione specifica e una capacità di amplificazione più forte. Al centro della PCR diretta c'è una polimerasi altamente resistente.

2.3 Rimuovere o inibire i componenti nei campioni che influenzano l'amplificazione del DNA

Dopo che il campione è stato elaborato dal lisato, proteine, lipidi e altri detriti cellulari saranno rilasciati e queste sostanze inibiranno la reazione PCR. Pertanto, la PCR diretta deve aggiungere la rimozione corrispondente o gli inibitori per ridurre l'influenza di questi fattori.

3. Scenari applicativi e caratteristiche del Direct PCR Kit

Il kit Direct PCR di Yeasen può amplificare direttamente i campioni di tessuto vegetale, animale o sangue e altri campioni originali senza purificazione dell'acido nucleico, il che semplifica notevolmente il processo sperimentale PCR. La genotipizzazione basata su PCR (Figura 1) è stata eseguita utilizzando il campione originale senza purificazione del genoma (Figura 1A) o utilizzando il suo lisato (Figura 1B) come modello. Rispetto alla genotipizzazione basata su PCR generale, il kit Direct PCR ha un consumo di campione inferiore, un funzionamento semplice, un basso costo sperimentale e un rilevamento quantitativo del campione di alta qualità.

Figura 1. Tecnologia PCR diretta.

A. Metodo diretto: prendi un piccolo numero di campioni e aggiungili direttamente al mix PCR per l'identificazione PCR. B. Metodo di lisi: aggiungi il campione alla soluzione di lisi per rilasciare il genoma e aggiungi una piccola quantità del surnatante di lisi al mix PCR per l'identificazione PCR.

3.1 Applicazioni

Rilevazione dell'amplificazione dei geni animali, genotipizzazione di animali transgenici, identificazione di piante transgeniche, genotipizzazione di piante, ecc.

3.2 Caratteristiche

★   Diretto: nessuna purificazione del DNA;
★   Veloce: 10 minuti per completare la preparazione del modello, 50 minuti per completare la reazione PCR;
★   Semplice: i campioni possono essere lisati senza taglio o macinazione;
Il mix PCR si presenta sotto forma di master mix, che riduce i passaggi di aggiunta del campione
★   Risparmio: minor consumo di materiale
★   Elevata produttività: la reazione di lisi può essere completata in una piastra a 96 pozzetti
★   Forte tolleranza agli inibitori

4. Dati del prodotto

4.1 Tipo universale multi-animale: Kit PCR diretto su tessuto animale

4.1.1 Più veloce: riduce i tempi di funzionamento

Figura 2. Un kit PCR diretto su tessuti animali di Yeasen potrebbe far risparmiare più tempo.

4.1.2 Esempio: identificazione del genotipo dei topi knockout

Figura 3. Risultati dell'amplificazione diretta del kit PCR diretto del tessuto animale per il rilevamento di animali con gene knockout.

M: scala di DNA da 100 bp. Corsie 1-8: lisato come stampo. +: 50 ng di DNA genomico purificato come stampo. ﹣: acqua deionizzata come stampo. Diversi cicli: 35 cicli. Singolo frammento (580 bp): genoma omozigote di animale knockout. Singolo frammento (180 bp): genoma di tipo selvatico. Due frammenti (580 bp/180 bp): genoma eterozigote di animale knockout.

4.2 Specifico per roditori: Kit PCR diretto su tessuto di topo

4.2.1 Più veloce: rilascio genico sufficiente

Figura 4 Risultati dell'amplificazione diretta del kit PCR diretto su tessuto di topo con diversi tempi di lisi.

M: 100bp DNA ladder. +: 50 ng di DNA genomico purificato come stampo. Diversi cicli: 35 cicli.

4.2.2 Meglio del metodo generale di lisi alcalina

Figura 5. Risultati dell'amplificazione del gene SOX21 nella coda di topo trattata con diversi metodi di lisi.

M: scala di DNA da 100 bp. Corsie 1-2: lisato come stampo mediante lisi alcalina generale. Corsie 3-4: lisato come stampo mediante kit PCR diretto su tessuto di topo. +: 50 ng di DNA genomico purificato come stampo. -: acqua deionizzata come stampo. Diversi cicli: 35 cicli.

4.2.3 Confronta con prodotti simili

Figura 6. Risultati dell'amplificazione del gene SOX21 nella coda di topo trattata con prodotti simili di marche diverse.

M: 100 bp DNA ladder. +: 50 ng di DNA genomico purificato come stampo. Diversi cicli: 35 cicli.

4.3 Kit PCR diretto su tessuti vegetali

4.3.1 Verifica del campione di piante multi-tipo

Figura 7. Risultati dell'amplificazione diretta delle foglie di diverse piante.

M: Scala del DNA da 100 bp. C: Il DNA genomico purificato come stampo.Corsie 1-2: Il lisato del tessuto fogliare come modello. Diversi cicli: 30 cicli.

5. Feedback del cliente

5.1 Genotipizzazione dei topi

Figura 8. Risultati dell'identificazione del genotipo del topo mediante il kit PCR diretto su tessuto di topo da parte degli utenti di Beijing Jishi Life Technology Co., Ltd.

5.2 PCR diretto del riso

Figura 9. Amplificazione dei geni correlati al riso mediante kit PCR diretti sui tessuti vegetali da parte degli utenti dell'Università agraria di Huazhong.

6. Informazioni sull'ordinazione del prodotto

Yeasen è una società di biotecnologia impegnata nella ricerca, sviluppo, produzione e vendita di tre principali reagenti biologici: molecole, proteine ​​e cellule. I prodotti forniti da Yeasen sono i seguenti.

Tabella 1. Informazioni per l'ordinazione del prodotto