マイコプラズマは、胸膜肺炎様菌（PPLO）としても知られ、これまでに発見された細胞壁を持たない最も小さく単純な原核生物です。直径は0.1～0.3μmで、フィルターを通過でき、高い多形性を示します。比較的一般的で、哺乳類細胞培養における細菌汚染を検出するのは困難です。
マイコプラズマ汚染は細胞培養にさまざまな悪影響を及ぼし、細胞培養の実践において深刻な問題となっています。日常的な細胞培養におけるマイコプラズマ汚染率は控えめに見積もっても 15% から 35% の範囲にあり、実験結果の信頼性に重大な支障をきたします。
細胞培養におけるマイコプラズマ汚染の約 95% は、主に Acholeplasma laidlawii、Mycoplasma arginini、Mycoplasma orale、Mycoplasma fermentans、Mycoplasma hominis、および Mycoplasma hyorhinis によって引き起こされます。培養培地上では、マイコプラズマのコロニーは「目玉焼き」のような外観を形成します。細胞培養上清と細胞膜はマイコプラズマの成長に適した環境を提供し、細胞の表面に寄生するマイコプラズマは宿主細胞膜を貫通することができます。
マイコプラズマ汚染の主な発生源としては、細胞培養培地またはその成分（培地の原料、血清、その他の試薬など）、研究室の人員、細胞培養インキュベーター、液体窒素貯蔵タンク、空中浮遊粒子およびエアロゾル、抗生物質の過剰使用、不適切に密封された細胞培養、およびすでにマイコプラズマに汚染されている細胞などが挙げられます。
一方、これらの汚染に伴う危険性としては、下流の精製中にマイコプラズマを効果的に除去できないために細胞製品または細胞を培地として使用して製造された製品のバッチ廃棄につながること、汚染物質と接触するすべての関連機器および施設、ならびに中間製品または最終製品を汚染すること、他の正常な細胞がマイコプラズマに汚染されること、マイコプラズマ汚染のために重要な細胞またはウイルスシードバンクが廃棄されること、マイコプラズマ汚染に対処するために研究室で生産または実験操作を停止することを余儀なくされること、マイコプラズマ耐性の発達につながり、除去がさらに困難になること、マイコプラズマ汚染の範囲が拡大すること、および研究室の他の細胞培養に脅威を与えることなどが挙げられます。
したがって、細胞培養システム内にマイコプラズマが存在しないことを確認するために、定期的なマイコプラズマ検査と除去を実施する必要があります。これは、科学研究の正常な進行に不可欠です。
マイコプラズマ検出
マイコプラズマは比較的一般的ですが、通常は除去が難しいタイプの汚染物質です。細胞培養を伴う生物製剤のプロセスでは、「マイコプラズマ汚染があってはならない」という規制が設けられています。
- 2020年版中国薬局方第3巻「生物製剤の製造および試験のための動物細胞基質の調製および品質管理」では、製造に使用される細胞については、マスター細胞バンク（MCB）、ワーキング細胞バンク（WCB）、および製造終了細胞（EOPC）に対してマイコプラズマ検査を実施する必要があると規定されています。
- FDA の「業界向けガイダンス: 感染症適応症のウイルスワクチンの製造に使用される細胞基質およびその他の生物学的材料の特性評価と適格性」では、原材料、ウイルス種子、未処理の採取液、およびその他の同様の材料に対してマイコプラズマ制御を実行する必要があると規定されています。
- ICH Q5D「バイオテクノロジー製品/生物由来製品の製造に使用される細胞基質の誘導および特性評価」では、原材料、ウイルス種子、未処理の採取液、およびその他の同様の材料に対してマイコプラズマ制御を実行する必要があるとも述べられています。
図1 国内および国際規制で要求されるマイコプラズマ汚染検査のポイント
従来のマイコプラズマ検出法には、主に培養法と指標細胞法があります。しかし、これら 2 つの方法は検出サイクルが長いことや感度の問題があるため、企業の生産または製品リリース サイクルが長くなります。細胞および遺伝子治療の発展に伴い、マイコプラズマ検出の適時性と感度に対する業界の要件はますます厳しくなっています。このような長い検出期間をサポートするには保存期間が短いだけでは不十分であるため、さまざまなマイコプラズマ検出法の中で、迅速な NAT (核酸検査) 法が際立っています。
図2 国内および国際規制に記載されているマイコプラズマの検出方法
これは、生産原材料、細胞バンク、ウイルスシード、ウイルスまたは細胞採取液、および治療用細胞における潜在的なマイコプラズマ汚染を迅速に定性的に検出するための製品です。主にバイオ医薬品の研究、開発、生産、およびリリースのプロセスで使用されます。
製品資格
規制コンプライアンス: EP2.6.7、JP G3、USP 63 薬局方の要件に従って検証され、国際的な権威ある組織の基準を満たしています。
監査コンプライアンス:製品生産は ISO13485 品質管理システム標準に準拠しており、包括的な監査文書によってサポートされています。
品質保証：キットに必要な酵素原料はすべて自社生産・工業化されており、安定供給が保証されています。
技術経験の蓄積: TaqMan 法には強固な技術基盤があり、キットの感度は 10 CFU/mL 以下に達します。
製品のパフォーマンスに重点を置く:デュアルブロッキング抗体を備えた Taq 酵素抗体ライブラリにより、キットの特異性、感度、安定性が向上します。
製品の特徴
複数の検出タイプ:最適化された TaqMan プローブは、最大 183 種のマイコプラズマを検出できます。
使いやすい:サンプルの準備とテストにかかる合計時間は 3 時間未満で、培養方法に伴う 28 日間の待機時間が不要になります。
高感度:検出限界は 10 CFU/mL と低く、直接培養法の代替として有効です。
高い特異性:プライマーとプローブは 16S rRNA をターゲットに設計されており、クロストリジウムや乳酸菌などの近縁種との交差反応が起こらないことを保証します。
高い安全性:キット内の陽性コントロール (PC) は非感染性であり、汚染のリスクを完全に排除します。
強力な干渉耐性:内部コントロール (IC) の導入により、反応準備におけるサンプルの干渉や異常を排除し、偽陰性を効果的に回避できます。
図3 マイコプラズマリアルタイムqPCR検出キットを使用したマイコプラズマ検出のワークフロー
2.MycAway™ Plus-Color ワンステップマイコプラズマ検出キット独自の等温増幅技術を採用し、より優れた色識別力を実現。青紫色（ネガティブ）からスカイブルー（ポジティブ）への変化が肉眼でより容易に識別できます。さらに、汚染防止コンポーネントが組み込まれているため、偽陽性の発生が排除されます。
図4: MycAway™ Plus-Color ワンステップマイコプラズマ検出キットを使用したマイコプラズマ検出の操作手順
3.GMyc-PCRマイコプラズマ検出キット従来のワンステップPCR検出法とは異なり、プライマーの数が1対から3対に増加し、ネストPCR増幅のためにマイコプラズマ16Sおよび23S rRNAの保存領域をターゲットとします。これにより、非特異的産物が減少するだけでなく、産物の感度が大幅に向上し、マイコプラズマのコピーが1つしかない場合でも検出できるようになります。
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図5 GMyc-PCRマイコプラズマ検査キットを用いたマイコプラズマ検出の操作手順
マイコプラズマ除去
細胞培養の過程では、定期的な検査により大規模なマイコプラズマ汚染を効果的に防ぐことができます。しかし、細胞がすでにマイコプラズマに汚染されている場合は、速やかに処理する必要があります。汚染された細胞を高圧滅菌してから廃棄し、他のきれいな細胞株を汚染しないようにするのがベストプラクティスです。汚染された細胞が特に貴重であり、マイコプラズマ汚染を除去する必要がある場合は、抗生物質の組み合わせを使用してこの目的を達成できます。マイコプラズマには細胞壁がないため、従来の抗生物質は一般に効果がありません。したがって、適切なマイコプラズマ除去試薬を選択することが重要です。
製品の特徴
低毒性:細胞に対する毒性が最小限であるため、トランスフェクションや生存率アッセイなどの後続の細胞実験に影響を与えません。
高い安定性:試薬は -20°C で長期間保存でき、高い効力を維持します。
使い方は簡単:マイコプラズマに汚染された培養培地に製品を加えて培養するだけです。
即効性: 3 日以内に効果が目に見えて現れる「即効性」。
広範囲スペクトル:研究室で見つかったマイコプラズマの種類のほとんどを除去できます。
図6. マイコプラズマ除去試薬細胞毒性試験の図解
マイコプラズマ予防
細胞培養の過程では、マイコプラズマ汚染が頻繁に発生します。しかし、その独特の特性により、肉眼や顕微鏡装置で検出することは困難です。そのため、マイコプラズマの予防をしっかり行うことが特に重要です。マイコプラズマ汚染の効果的な予防は、培養培地にマイコプラズマ予防試薬を添加することで実現できます。
現在、実験室におけるマイコプラズマの発生は、主に細胞間の交差汚染、作業環境や実験装置の汚染、実験者の無菌技術の不備、汚染された培養培地や試薬、マイコプラズマに汚染された元の組織や臓器などから生じています。
製品情報
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製品 |
カタログ番号 |
製品名 |
製品仕様 |
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サンプル前処理キット |
18461ES |
25T/100T |
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18467ES |
MolPure® Mag48 サンプル調製キット FN |
3×16T/ 6×16T |
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核酸抽出装置 |
80511ES |
48チャンネル自動核酸抽出装置 |
48チャンネル |
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マイコプラズマ検出キット |
40619ES |
25T/100T |
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40612ES |
25T/100T |
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40601ES |
10アッセイ/20アッセイ |
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マイコプラズマ除去試薬 |
40607ES |
1mL/5×1mL |
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マイコプラズマ予防試薬 |
40608ES |
MycAway TM予防薬 (2000×) -マイコプラズマ予防試薬 |
1mL/5×1mL |
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40605ES |
MycAway TMスプレー（そのまま使用可能） |
500mL/2×500mL/10×500mL |
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40609ES |
100mL |
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40610ES |
100mL |