アポトーシス入門
アポトーシスは、細胞の発生中または特定の要因の影響を受けたときに発生するプログラム細胞死現象であり、細胞内遺伝子とその産物の調節によって引き起こされます。アポトーシスの経路では、イベントが時系列で1つずつ発生し、アポトーシス小胞の提示につながり、その後アポトーシスが発生します。アポトーシスは、胚の発達と形態形成、組織内の正常な細胞の安定した集団の維持、身体の防御と免疫反応、病気や中毒による細胞損傷、老化、腫瘍の発生に重要な役割を果たしており、潜在的な治療価値があります。
検出原理
正常な細胞膜におけるリン脂質の分布は非対称です。ホスファチジルセリン (PS) は生細胞では細胞膜の内側表面に存在し、アポトーシスの際には細胞膜が変化し、PS は細胞膜の内側表面から細胞膜の外側表面に反転します。アネキシン V はアポトーシス細胞の表面にある PS を特異的に認識しますが、生細胞の PS は細胞膜の内側表面に存在するため、アネキシン V に特異的に結合することはできません。
壊死細胞のPSも細胞膜の内側の表面から細胞膜の外側の表面に反転し、Annexin Vも壊死細胞の表面のPSを認識するため、Annexin Vは壊死細胞とアポトーシス細胞を区別できません。対照的に、PI色素は細胞内DNAに結合し、壊死細胞と生細胞を区別することができました。初期のアポトーシス細胞と生細胞の細胞膜はまだ無傷であり、PI色素は細胞膜を自由に通過して細胞に入り、DNAに結合することができないため、PI色素はアポトーシス細胞と生細胞を標識できませんが、PI色素は壊死細胞の細胞膜を通過して細胞内のDNAに結合することができ、壊死細胞内のPI色素は488 nmレーザーによって励起された後に赤色蛍光を発し、対応するチャネルによって受信されます。したがって、アネキシン V と PI を同時に使用して、生細胞、初期アポトーシス細胞、後期アポトーシス細胞または壊死細胞を区別することができます。
図2 アネキシンV/PI検出原理
フローサイトメトリー検出
FITC の最大励起波長は 488 nm、最大発光波長は 525 nm で、FITC の緑色蛍光は FL1 チャネルで検出されます。PI-DNA 複合体の最大励起波長は 535 nm、最大発光波長は 615 nm で、PI の赤色蛍光は FL2 または FL3 チャネルで検出されます。解析は CellQuest などのソフトウェアを使用して実行され、FITC を水平座標、PI を垂直座標として 2 色散布図が描画されました。典型的な実験では、細胞は 3 つのサブポピュレーションに分けられ、生細胞は非常に低強度の背景蛍光のみを持ち、初期アポトーシス細胞は強い緑色蛍光のみを持ち、後期アポトーシス細胞は緑色と赤色の蛍光による二重染色を持ちます。
図3 フローサイトメトリー検出
よくある質問
Q: アネキシン V アポトーシスアッセイは植物や細菌 (原核生物) に適用できますか?
A: はい、しかし植物細胞や細菌（原核生物）には細胞壁が含まれているため、プロトプラストを準備する必要があります。染色液の具体的な量は細胞を浸すだけでよく、染色時間は細胞によって多少異なります。
Q: 実験の結果をどのように判断するのですか?
A: 生細胞 (Annexin V-/PI-)、初期アポトーシス細胞 (Annexin V+/PI-)、後期アポトーシス細胞および壊死細胞は、二重陽性 (Annexin V+/PI+)、裸の核 (Annexin V-/PI+) を示します。
Q: Annexin V と TUNEL の違いは何ですか?
A: 末端デオキシヌクレオチド転移酵素 dUTP ニック末端標識 (TUNEL) は、後期アポトーシスの特徴的な特徴である細胞内 DNA 断片化部位を特定するために使用される染色法です。
アネキシン V 染色は、細胞膜の非対称性が失われて細胞外に露出した PS 残基に結合することで、アポトーシスの初期段階を認識します。
Q: PI を検出せずに Annexin V-FITC のみを使用してアッセイを実行することは可能ですか?
A: はい、可能です。核のない赤血球などの特殊な検査サンプルや、PI 検出を妨げる薬剤ドキソルビシン (アドリアマイシン) の使用など、どちらの場合も Annexin V-FITC のみを使用してアッセイを実行することが可能です。
製品詳細
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製品名 |
商品番号 |
仕様 |
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アネキシン V-FITC/7-AAD アポトーシス検出キット |
40311ES20/50/60 |
20T/50T/100T |
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40302ES20/50/60 |
20T/50T/100T |
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アネキシン V-PE/7-AAD アポトーシス検出キット |
40310ES20/50/60 |
20T/50T/100T |
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40303ES20/50/60 |
20T/50T/100T |
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アネキシン V-YSFluor™ 488/7-AAD アポトーシス検出キット |
40313ES60 |
100T |
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40305ES20/50/60 |
20T/50T/100T |
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40304ES20/50/60 |
20T/50T/100T |
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アネキシン V-YSFluor™ 647/7-AAD アポトーシス検出キット |
40312ES20/50/60 |
20T/50T/100T |
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40306ES20/50/60 |
20T/50T/100T |
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40307ES20/50/60 |
20T/50T/100T |
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40308ES20/50/60 |
20T/50T/100T |