마이코플라스마 qPCR 검출 및 방법 검증은 세포 및 유전자 치료 기술 개발의 진보에 기여합니다.

최근 몇 년 동안 생물의학의 급속한 발전, COVID-19 팬데믹 하의 세포 및 유전자 치료의 등장, mRNA 백신의 출현으로 생물학적 제품의 안전성과 신뢰성을 보장하는 것이 전 세계 정부와 규제 기관의 초점이 되었습니다. 마이코플라스마 오염은 흔하지만 일반적으로 제거하기 어려운 유형의 오염입니다. 규제 요건은 세포 배양과 관련된 생물 공정에 대해 "마이코플라스마 오염 없음"을 보장하도록 요구합니다.

마이코플라스마 검사에 대한 규제 기관 요구 사항:

FDA의 "산업 지침: 감염성 질환 적응증을 위한 바이러스 백신 생산에 사용되는 세포 기질 및 기타 생물학적 물질의 특성화 및 적격성"에서는 원료, 바이러스 종자 및 가공되지 않은 수확 유체에 대한 마이코플라스마 관리를 규정하고 있습니다.
2020년판 중국 약전 제3부 "생물학적 제품 생산 시험에 사용되는 동물 세포 기질의 조제 및 품질 관리"에서는 마스터 세포 은행(MCB), 제조용 세포 은행(WCB), 최종 생산 세포(EOPC)를 포함한 생산 세포에 대한 마이코플라스마 검사를 요구합니다.
"면역 세포 치료제의 제약 연구 및 평가를 위한 기술 지침(시험)"은 주요 시점에 적합한 중간 샘플에 대한 마이코플라스마 안전 관련 시험을 실시하거나 통제를 위한 관련 조치를 구현할 것을 권장합니다. 마이코플라스마 시험은 최종 제품에 대한 출시 시험으로도 필요합니다.

핵산 검사(NAT) 및 전통적 방법:

핵산 증폭 기술(NAT)과 같은 신속한 검출 방법이 등장하기 전에는 전통적인 배양 방법과 지표 세포 검정이 사용되었습니다. 그러나 긴 검출 주기 또는 감도 문제로 인해 이러한 방법은 종종 생산 또는 방출 주기를 연장하거나 위험 평가 또는 대체 방법의 탐색에 따라 세포 물질의 조건부 방출이 필요했습니다. 세포 및 유전자 치료의 발전으로 업계에서는 적시성과 감도가 더 높은 마이코플라스마 검출 방법에 대한 수요가 증가하고 있습니다. 제품의 짧은 유통기한은 긴 테스트 기간을 견딜 수 없으므로 NAT 방법이 유리한 대안으로 부상했습니다.

현재 유럽 약전(EP) <2.6.7>, 일본 약전(JP) 및 미국 약전(USP) <63>은 모두 NAT 방법을 마이코플라스마 검출 방법으로 포함했습니다. 그러나 이 방법을 검증하고 감도가 떨어지지 않도록 기존 방법과 비교하는 것이 이 방법을 사용하기 위한 전제 조건입니다. 중국 약전(ChP)의 2020년판은 NAT를 마이코플라스마 검출 방법으로 포함하지 않았지만 "국가 의약품 규제 기관에서 인정하는 다른 방법"을 사용할 가능성을 언급합니다. 2022년 5월, 국가의약품감독관리총국(NMPA)의 의약품 검토 센터는 "면역 세포 치료제의 제약 연구 및 평가에 대한 기술 지침(시험)"을 발표했는데, 이는 샘플 양이 제한적이거나 신속한 방출이 필요하고 약전 방법이 부적절한 특수 상황에서 방출 시험을 위한 새로운 무균 및 마이코플라스마 검출 방법의 개발을 고려할 것을 제안합니다. 따라서 NAT 방법은 점점 더 많은 원자재 공급업체와 ATMP(Advanced Therapy Medicinal Product) 회사에서 마이코플라스마 신속 방출 검사를 지원할 수 있는 방법으로 활용될 것으로 예상됩니다.

NAT 방식 - 방식 검증 요구 사항

NAT 방법에 대한 검증 프로세스는 유럽 약전 <2.6.7>과 일본 약전에 자세히 설명되어 있으며, 그 내용은 본질적으로 일관적입니다. 국립식품의약품안전처(NIFDC)도 "마이코플라스마 검사를 위한 핵산 검출 방법 및 방법론적 검증에 대한 고려 사항"이라는 제목의 기사를 발표하여 중국의 마이코플라스마 핵산 증폭 방법 개발자와 사용자에게 지침을 제공하고자 했습니다. 특이성, 검출 한계 및 견고성은 마이코플라스마 NAT 방법을 검증하는 데 필수적입니다. 상용 키트를 마이코플라스마 검출에 사용하는 경우, 실험실 환경 및 샘플 유형과 함께 공급업체의 포괄적인 키트 성능 보고서를 기반으로 방법 적합성 검증을 수행할 수 있습니다.

검증 보고서

특성:

특이성은 다른 성분(불순물, 분해 산물, 부형제 등)이 존재할 때 분석 방법을 통해 분석물을 정확하게 결정할 수 있는 능력을 말합니다. EP는 그람 양성균 내의 Clostridium, Lactobacillus, Streptococcus와 같이 계통수와 밀접한 관련이 있는 다른 세균 종 간의 교차 반응에 초점을 맞출 필요성을 강조합니다. 또한 숙주 세포와 실험 환경에서의 인간 DNA 오염과 같은 일반적인 오염 유형에도 주의를 기울여야 합니다.

검출 한계:

검출 한계는 샘플에서 검출할 수 있는 분석물의 최소량입니다. 이는 정성적 식별 기준으로 사용되며 정확한 값으로 정량화할 필요가 없습니다. EP는 각 희석 농도에서 각 마이코플라스마 종에 대해 24개의 검출 데이터 포인트가 필요합니다. 이는 다른 날에 3회의 독립적인 10배 연속 희석을 수행하고 각 희석 기울기에 대해 8번의 반복 검출을 수행하거나 다른 날에 4회의 독립적인 10배 연속 희석을 수행하고 각 희석 기울기에 대해 6번의 반복 검출을 수행하여 달성할 수 있습니다. 95% 이상의 검출 양성률을 검출 한계로 간주할 수 있습니다. 검출 한계 확인이 필요한 마이코플라스마 유형의 경우 키트 제조업체는 규제 약전에서 요구하는 대로 가능한 한 많은 마이코플라스마 유형을 포괄하고 각 마이코플라스마 유형에 대한 검출 한계를 탐색해야 합니다. 생물 제약 회사의 경우 인간 마이코플라스마 유형도 고려하는 것이 좋습니다.

생산 과정에서 조류 세포나 재료를 사용하거나 발견한 경우, Mycoplasma synoviae에 대한 검출 한계 검증을 실시해야 합니다.
생산 과정에서 곤충이나 식물성 재료를 사용하거나 발견한 경우, 아콜레플라스마에 대한 검출 한계 검증을 실시해야 합니다.
돼지 비강 마이코플라스마는 마이코플라스마에 오염된 샘플에서 매우 흔하게 발견되며 중국 식품의약품안전청의 주목을 받고 있습니다.

유럽약전과 비교했을 때, 일본약전에서는 검출 한계 검증이 필요한 조류 마이코플라스마에 대해서는 언급하지 않으나, 타액 마이코플라스마는 포함되어 있습니다.

견고성:

견고성은 측정 조건의 작은 변화에도 영향을 받지 않고 견딜 수 있는 방법의 능력을 말하며, 확립된 방법을 일상적인 테스트에 사용할 수 있는 기반을 제공합니다. 견고성 평가는 검출 시약의 MgCl2, 프라이머 및 dNTP 농도 변화, 핵산 추출 키트 또는 추출 단계의 변경 및 다양한 핵산 증폭기 사용에 대한 마이코플라스마 검출 방법의 내성에 초점을 맞춰야 합니다.

비교 연구

NAT를 약전 방법의 대체 수단으로 사용하려면 NAT가 배양 기반 방법 또는 지표 세포 배양 방법을 대체할 수 있는지 비교를 통해 확인해야 합니다. 여기에는 일반적으로 방법의 검출 한계와 특이성(예: 마이코플라스마 적용 범위 및 가능한 거짓 양성)을 고려하는 것이 포함됩니다. 검출 한계를 비교하기 위해 "10 CFU/mL의 검출 한계는 배양 기반 방법을 대체할 수 있고 100 CFU/mL의 검출 한계는 지표 세포 배양 방법을 대체할 수 있다"는 기준을 충족해야 합니다.

비교 연구를 수행하는 데에는 두 가지 선택적 접근 방식이 있습니다.

NAT와 약전적 방법 모두에서 동일하게 검증된 마이코플라스마 균주를 사용하여 동시 실험을 수행하여 검출 한계를 확인합니다.
NAT 검증 결과를 이전 약전 방법 검증 결과와 비교해야 하지만, 두 방법 모두에 사용된 마이코플라스마 표준에 대한 확인 파일을 신중하게 문서화하는 것이 필요합니다.

설명	부품 번호
MolPure® 자기 잔류 DNA 샘플 준비 키트	18461ES
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