E. coli Kit de detecção de resíduos de DNA de células hospedeiras (2G)
Resumo da qualificação (Cat No.: 41308(ES60)
- Fundo
Os dados resumidos neste relatório são realizados pela
A
- Materiais e métodos experimentais
2.1 Kit de detecção de resíduos de DNA de células hospedeiras de E. coli (2G), Fornecedor:
2.2 Kit de preparação de amostra de DNA residual magnético MolPure®, fornecedor:
2.3 Padrão nacional para conteúdo de DNA de E. coli: Cat. 270027, Lote nº: 201101, concentração: 96,2 μg/mL, condição de armazenamento: -70℃, adquirido de: National Institutes for Food and Drug Control.
2.4 Dados originais: a versão eletrônica foi registrada no 'Relatório Experimental' o subarquivo do arquivo pai 'E. coli Host Cell DNA Residue Detection Kit (2G)'.
2,5 Métodos: Os materiais e métodos de operação utilizados no experimento foram basicamente produzidos ou definidos pela
- Conteúdos e resultados da qualificação
3.1 Alcance de detecção
A faixa linear do kit foi de 30 fg/μL~300 pg/μL com R2=1, e a eficiência de amplificação foi de 101,74% com CV<15% para cada ensaio de concentração.
Figura 1 Curva padrão de qPCR de DNA de E. coli (2G)
3.2 Precisão
3.2.1 Desvio de Padrão nacional para conteúdo de DNA de E. coli
O material de referência de DNA de E. coli em cada lote do kit foi calibrado usando o padrão nacional para conteúdo de DNA de E. coli. O material de referência de DNA de
3.2.2 Rrecuperação
3.2.2.1 Experimento de recuperação de picos de amostra em branco
Amostras de padrões de DNA de E. coli em altas e baixas concentrações: 300 pg/μL, 3 pg/μL e 30 fg/μL foram preparadas, respectivamente, e analisadas após a extração usando o Método de Esferas Magnéticas para o Kit de Pré-tratamento de Amostras Residuais de DNA (2 réplicas de extração foram realizadas para cada amostra, e 3 réplicas de ensaio foram feitas para cada extração), e as recuperações e CVs das amostras foram analisados.
Para diferentes concentrações de amostras de DNA, as recuperações variaram de 70% a 130%, e os CVs foram todos <20%.
| Tipo de amostra | Concentração Teórica | Extrair 1 média | Extrato 2 média | Concentração média | cv | Recuperação |
| Amostra em branco | / | / | / | / | / | / |
| Amostra de recuperação 1 | 300 pg/μL | 250,56 pg/μL | 262.11 pg/μL | 256,33 pg/μL | 4,41% | 85,44% |
| Amostra de recuperação 2 | 3 pg/μL | 2.29 pg/μL | 2,56 pg/μL | 2,42 pg/μL | 7,09% | 80,77% |
| Amostra de recuperação 3 | 30 fg/μL | 33,62 fg/μL | 32,61 fg/μL | 33.12 fg/μL | 14,28% | 110,39% |
Tabela 1 Recuperação de picos de amostra em branco
3.2.2.2 Experimento de simulação de recuperação de pico de amostra
Amostras da mesma concentração (3 pg/μL de DNA de E. coli) foram extraídas (2 réplicas de extração foram realizadas para cada amostra e 3 réplicas de ensaio foram feitas para cada extração) com 5 soluções de fundo diferentes (alta proteína, alto ácido nucleico, alto e baixo pH, alto sal) e as recuperações e CVs das amostras foram analisados.
As recuperações de amostras de DNA para diferentes soluções de fundo variaram de 70% a 130%, com todos os CVs <20%.
| Tipo de amostra | Concentração Teórica | Extrair 1 média | Extrato 2 média | Concentração média | cv | Recuperação |
| Amostra básica | / | / | / | / | / | / |
| Alta Proteína | 3 pg/μL | 2,25 | 2.23 | 2.24 | 1,09% | 74,74% |
| Alto Ácido Nuclear | 3,93 | 3,96 | 3,95 | 1,56% | 131,52% | |
| Alto teor de sal | 2,69 | 2,67 | 2,68 | 2,63 | 89,20% | |
| pH alto | 2,90 | 3,67 | 3.29 | 13,82% | 109,55% | |
| pH baixo | 2,77 | 2,87 | 2,82 | 3,41% | 94,01% |
Tabela 2 Recuperação de picos de amostra básica
3.3 Precisão
3.3.1 Repetibilidade
Repita o ensaio 10 vezes para padrões de DNA de E. coli a uma concentração de 3 pg/μL com um CV <15%.
| Repetições | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | Significar | cv |
| Valor de detecção (fg/μL) | 3.16 | 2,87 | 2,97 | 2,86 | 2,81 | 2,97 | 3.14 | 3.21 | 3.14 | 3.1 | 3.02 | 4,78% |
Tabela 3 Resultados de repetibilidade
3.3.2 Precisão intermediária
Três experimentadores testaram independentemente amostras padrão de DNA de E. coli em altas e baixas concentrações: 300 pg/μL, 3 pg/μL e 30 fg/μL, e três repetições foram feitas para cada concentração, e os CVs de todos os nove dados obtidos foram <15%.
| Exp |
Concentração real Concentração Teórica | ADN de E. coli (2G) | ||
| 300 pg/uL | 3 pg/uL | 30 fg/uL | ||
| Exp 1 | Determinação 1 | 295,65 | 3.22 | 26,90 |
| Determinação 2 | 287,71 | 3.24 | 32,00 | |
| Determinação 3 | 300,23 | 3.17 | 27,50 | |
| Exp 2 | Determinação 4 | 306.06 | 3.13 | 37.30 |
| Determinação 5 | 299,76 | 3.02 | 32,70 | |
| Determinação 6 | 299.63 | 3.02 | 34,00 | |
| Exp 3 | Determinação 7 | 266,70 | 3.01 | 35,90 |
| Determinação 8 | 272,89 | 3.09 | 40,70 | |
| Determinação 9 | 276,51 | 3.01 | 35,20 | |
| / | Significar | 289,46 | 3.10 | 33,60 |
| / | cv | 4,89% | 3,02% | 13,18% |
Tabela 4 Precisão intermediária Resultados
3.4 Especificidade
A interferência do DNA genômico celular comumente usado na produção de produtos biológicos foi avaliada quanto à interferência com reagentes de detecção de DNA de E. coli, e o grupo de interferência se sobrepôs ao grupo de controle e nenhuma interferência foi observada (a figura abaixo mostra, em ordem, os dados de interferência dos DNAs genômicos HEK293, Vero e CHO com reagentes de detecção de DNA de E. coli).
Figura 2 Resultados do experimento de interferência
3.5 Limite de Quantificação
O DNA de E. coli foi detectado em 50 fg/μL, 40 fg/μL, 30 fg/μL, 10 fg/μL e 5 fg/μL, com 10 réplicas para cada concentração. Os resultados mostraram que o CV foi <20% em concentrações de 30 fg/μL e acima. Ou seja, o limite de quantificação do kit de detecção de resíduos de DNA de células hospedeiras de E. coli (2G) foi de 30 fg/μL.
|
Repetições Item de teste | ADN de E. coli (2G) (fg/μL) | |
| Quantidade | Taxa de Recálculo | |
| 1 | 29,43 | 98,09% |
| 2 | 29,51 | 98,35% |
| 3 | 32.04 | 106,79% |
| 4 | 26.07 | 86,89% |
| 5 | 34.06 | 113,53% |
| 6 | 33,54 | 111,79% |
| 7 | 26,95 | 89,82% |
| 8 | 27,38 | 91,26% |
| 9 | 27.04 | 90,13% |
| 10 | 26.10 | 87,02% |
| Significar | 29.21 | / |
| cv | 10,40% | / |
Figura 3 Resultado do teste qPCR de DNA de E. coli (2G) 30fg/μL
3.6 Robustez
Este kit foi testado e é adequado para, mas não limitado a, os seguintes instrumentos:
| Fornecedor | Modelos de Instrumentos | Eficiências de amplificação | R2 | Limite de quantificação (fg/μL) | cv |
| Termo | ABI 7500 | 101,74% | 1 | 30 | 13,30% |
| Termo | ABI QuantStudio5 | 100,46% | 1 | 30 | 12,40% |
| Bio-Rad | CFX96 | 99,20% | 0,999 | 30 | 13,76% |
| Xangai Hongshi | SLAN | 100,40% | 0,999 | 30 | 11,67% |
Tabela 5 Resultados dos testes de adequação do instrumento
3.7 Estabilidade
3.7.1 Estabilidade de congelamento e descongelamento
O kit de detecção de resíduos de DNA de células hospedeiras de E. coli (2G) foi testado por congelamento e descongelamento repetidos 10 vezes, e o desempenho do kit não foi afetado.
|
Indicadores de teste Tempos de congelamento e descongelamento | Parâmetro | Tempo T0 | Congelar e descongelar 10 vezes |
| Parâmetro de curva padrão | Eficiências de amplificação | 98,23% | 100,20% |
| R2 | 1 | 0,999 | |
| Limite de quantificação (30 fg/μL) | cv | 15,07% | 9,66% |
Tabela 6 Análise dos resultados da estabilidade de congelamento e descongelamento
3.7.2 Estabilidade Acelerada
E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit (2G) foram armazenados a 2~8°C por 30 dias e 37°C por 14 dias, respectivamente. Nenhum desempenho do kit foi afetado.
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Indicadores de teste Temperatura e tempo de aceleração | Parâmetro | Experimento 1 | Experimento 2 | ||
| Tempo T0 | 2~8℃ 30 Dias | Tempo T0 | 37℃ 14 dias | ||
| Parâmetro de curva padrão | Eficiências de amplificação | 97,77% | 99,81% | 98,39% | 98,65% |
| R2 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| Limite de quantificação (30 fg/μL) | cv | 11,04% | 13,79% | 9,55% | 14,55% |
Tabela 7 Análise dos resultados da estabilidade acelerada
- 4.Referência
4.1 Comissão da Farmacopeia Chinesa (ChPC). Farmacopeia da República Popular da China (Vol Ⅲ) [S]. Pequim: China Medical Science and Technology Press, p.542-543, 2020.
4.2 NMPA, 2007: Princípios Gerais para Revisão Técnica de Validação de Métodos Analíticos para Controle de Qualidade de Produtos Biológicos.
4.3 ICH(2022)《Validação de método analítico Q2》, versão de rascunho.
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