Nos últimos anos, com o rápido desenvolvimento da biomedicina, o surgimento de terapias celulares e genéticas sob a pandemia da COVID-19 e o advento das vacinas de mRNA, garantir a segurança e a confiabilidade dos produtos biológicos se tornou um ponto focal para governos e órgãos reguladores em todo o mundo. A contaminação por micoplasma é um tipo de contaminação comum, mas tipicamente desafiador de eliminar. Os requisitos regulatórios determinam a "garantia de nenhuma contaminação por micoplasma" para bioprocessos envolvendo cultura de células.
Requisitos das agências reguladoras para testes de micoplasma:
- O "Guia para a Indústria: Caracterização e Qualificação de Substratos Celulares e Outros Materiais Biológicos Usados na Produção de Vacinas Virais para Indicações de Doenças Infecciosas" da FDA estipula o controle de micoplasma para matérias-primas, sementes virais e fluidos de colheita não processados.
- A edição de 2020 da Farmacopeia Chinesa Parte III "Preparação e Controle de Qualidade de Substratos de Células Animais Usados para Testes de Produção de Produtos Biológicos" exige testes de micoplasma para células de produção, incluindo Bancos de Células Mestres (MCB), Bancos de Células de Trabalho (WCB) e Células em Fim de Produção (EOPC).
- As "Diretrizes Técnicas para Pesquisa Farmacêutica e Avaliação de Produtos de Terapia Celular Imunológica (Ensaio)" recomendam a realização de testes relacionados à segurança de micoplasma em amostras intermediárias adequadas em pontos-chave de tempo ou a implementação de medidas relevantes para controle. O teste de micoplasma também é necessário como um teste de liberação para produtos finais.
Teste de ácido nucleico (NAT) e métodos tradicionais:
Antes do advento de métodos de detecção rápida, como a Tecnologia de Amplificação de Ácido Nucleico (NAT), métodos de cultura tradicionais e ensaios de células indicadoras eram empregados. No entanto, devido a longos ciclos de detecção ou problemas de sensibilidade, esses métodos frequentemente prolongavam os ciclos de produção ou liberação ou necessitavam de liberação condicional de materiais celulares com base na avaliação de risco ou na exploração de métodos alternativos. Com o avanço das terapias celulares e genéticas, há uma demanda crescente na indústria por métodos de detecção de micoplasma com maior pontualidade e sensibilidade. A curta vida útil dos produtos não pode sustentar longos períodos de teste, portanto, os métodos NAT surgiram como alternativas favoráveis.
Atualmente, a Farmacopeia Europeia (EP) <2.6.7>, a Farmacopeia Japonesa (JP) e a Farmacopeia dos Estados Unidos (USP) <63> incluíram métodos NAT como métodos de detecção de micoplasma. No entanto, a validação deste método e a comparação com métodos tradicionais para garantir que sua sensibilidade não seja inferior são pré-requisitos para seu uso. Embora a edição de 2020 da Farmacopeia Chinesa (ChP) não tenha incluído o NAT como um método de detecção de micoplasma, ela menciona a possibilidade de usar "outros métodos reconhecidos pela autoridade reguladora nacional de medicamentos". Em maio de 2022, o Drug Review Center da National Medical Products Administration (NMPA) lançou as "Technical Guidelines for Pharmaceutical Research and Evaluation of Immune Cell Therapy Products (Trial)", que sugere considerar o desenvolvimento de novos métodos estéreis e de detecção de micoplasma para testes de liberação em circunstâncias especiais quando o volume da amostra é limitado ou a liberação rápida é necessária e os métodos farmacopeicos são inadequados. Portanto, espera-se que os métodos NAT sejam cada vez mais utilizados por mais fornecedores de matéria-prima e empresas de Produtos Medicinais de Terapia Avançada (ATMP) como um método capaz de dar suporte a testes rápidos de liberação de micoplasma.
Método NAT - Requisitos de validação do método
O processo de validação dos métodos NAT é descrito detalhadamente na Farmacopeia Europeia <2.6.7> e Farmacopeia Japonesa, com seu conteúdo sendo essencialmente consistente. O National Institutes for Food and Drug Control (NIFDC) também publicou um artigo intitulado "Considerações sobre métodos de detecção de ácido nucleico e validação metodológica para exame de micoplasma", com o objetivo de fornecer orientação para desenvolvedores e usuários de métodos de amplificação de ácido nucleico de micoplasma na China. Especificidade, Limite de detecção e Robustez são essenciais para validar métodos NAT de micoplasma. Se kits comerciais forem utilizados para detecção de micoplasma, a validação da adequação do método pode ser conduzida com base no relatório abrangente de desempenho do kit do fornecedor, combinado com o ambiente do laboratório e o tipo de amostra.
Especificidade:
Especificidade se refere à capacidade de um método analítico de determinar com precisão o analito na presença de outros componentes (como impurezas, produtos de degradação, excipientes, etc.). O EP enfatiza a necessidade de focar em reações cruzadas entre outras espécies bacterianas intimamente relacionadas à árvore filogenética, como Clostridium, Lactobacillus e Streptococcus dentro das bactérias Gram-positivas. Também deve ser dada atenção aos tipos comuns de contaminantes, como contaminação por DNA humano em células hospedeiras e ambientes experimentais.
Limite de detecção:
O limite de detecção é a menor quantidade de analito que pode ser detectada em uma amostra. Ele serve como uma base de identificação qualitativa e não precisa ser quantificado como um valor exato. O EP requer 24 pontos de dados de detecção para cada espécie de micoplasma em cada concentração de diluição. Isso pode ser alcançado realizando três diluições seriais independentes de 10 vezes em dias diferentes, com oito detecções repetidas para cada gradiente de diluição, ou conduzindo quatro diluições seriais independentes de 10 vezes em dias diferentes, com seis detecções repetidas para cada gradiente de diluição. Uma taxa de positividade de detecção de mais de 95% pode ser considerada como o limite de detecção. Para tipos de micoplasma que exigem confirmação do limite de detecção, os fabricantes de kits precisam cobrir tantos tipos de micoplasma quanto possível, conforme exigido pelas farmacopeias regulatórias e explorar os limites de detecção para cada tipo de micoplasma. Para empresas biofarmacêuticas, é aconselhável considerar também os tipos de micoplasma humano.
- Se células ou materiais aviários forem usados ou encontrados durante o processo de produção, a verificação do limite de detecção para Mycoplasma synoviae deve ser conduzida.
- Se materiais de insetos ou plantas forem usados ou encontrados durante o processo de produção, a verificação do limite de detecção para Acholeplasma deve ser conduzida.
- O micoplasma nasal suíno é altamente prevalente em amostras contaminadas por micoplasma e atraiu a atenção do Instituto Chinês de Controle de Alimentos e Medicamentos.
Em comparação com a Farmacopeia Europeia, a Farmacopeia Japonesa não menciona o micoplasma aviário para o qual é necessária a verificação do limite de detecção, mas inclui o micoplasma salivar.
Robustez:
Robustez se refere à capacidade de um método de suportar pequenas variações nas condições de medição sem ser afetado, fornecendo uma base para o uso do método estabelecido em testes de rotina. A avaliação da robustez deve se concentrar na tolerância dos métodos de detecção de micoplasma a variações na concentração de MgCl2, primers e dNTPs em reagentes de detecção, mudanças em kits de extração de ácido nucleico ou etapas de extração e o uso de diferentes amplificadores de ácido nucleico.
Estudo de Comparabilidade
Se o NAT for usado como um substituto para métodos farmacopéicos, é necessário confirmar por comparação que o NAT pode substituir métodos baseados em cultura ou métodos de cultura de células indicadoras.Isso normalmente envolve considerar o limite de detecção do método, bem como a especificidade (como o intervalo de cobertura de micoplasma e possíveis falsos positivos). Para comparar limites de detecção, ele deve atender aos critérios de que "um limite de detecção de 10 UFC/mL pode substituir métodos baseados em cultura, e um limite de detecção de 100 UFC/mL pode substituir métodos de cultura de células indicadoras".
Existem duas abordagens opcionais para conduzir estudos de comparabilidade:
- Realização de experimentos síncronos usando as mesmas cepas de micoplasma validadas para métodos NAT e farmacopéicos para confirmar o limite de detecção.
- Comparando os resultados da validação do NAT com os resultados de validação de métodos farmacopéicos anteriores, mas é necessária uma documentação cuidadosa dos arquivos de confirmação para os padrões de micoplasma usados em ambos os métodos.
Detecção de qPCR de micoplasma NAT - Solução abrangente
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O kit de teste
Serviços Técnicos
- Fornecimento de relatórios de validação abrangentes para o kit de teste MycAway™ Mycoplasma qPCR.
- Fornecimento de serviços técnicos para validação de aplicabilidade de amostras de clientes.
- Fornecendo suporte de auditoria.
| Descrição | Número da peça |
| Kit de preparação de amostra de DNA residual magnético MolPure® | 18461ES |
| Kit de detecção de qPCR de micoplasma MycAway™ (2G) | 40619ES |