A contaminação por ácido nucleico tem sido um obstáculo significativo no avanço das tecnologias de diagnóstico molecular. À medida que métodos de diagnóstico mais sensíveis são desenvolvidos, a demanda por maior pureza de enzimas e proteínas tem crescido. Um dos principais desafios na produção de proteínas é remover efetivamente a contaminação por ácido nucleico. A presença de ácidos nucleicos pode comprometer a função e a atividade da proteína, potencialmente levando a problemas como ligação não específica, inibição da atividade enzimática ou aumento de sinais de fundo, que afetam, em última análise, a precisão dos resultados diagnósticos.
Como resultado, desenvolver processos eficientes para remoção de ácido nucleico durante a produção de proteínas é crítico e essencial.
Após anos de pesquisa tecnológica, a
Estratégias abrangentes para prevenir a contaminação de DNA na produção de proteínas
A contaminação por DNA é um desafio generalizado na produção de produtos biológicos, impactando significativamente sua pureza, qualidade e a precisão dos resultados experimentais. A presença de DNA em preparações de proteína pode levar a conclusões experimentais imprecisas, distorcendo dados e potencialmente aumentando a probabilidade de falsos positivos. Para pesquisadores e fabricantes envolvidos na produção de proteína, implementar estratégias eficazes para prevenir e mitigar a contaminação por DNA é essencial. Este artigo explora como evitar a contaminação por DNA, particularmente a contaminação transportada pelo ar, e descreve métodos para remover efetivamente o DNA de amostras de proteína.
EU. Prevenção da contaminação por DNA no ar
A contaminação por DNA no ar continua sendo uma preocupação crítica na produção de proteínas, particularmente em ambientes onde o controle microbiano e de partículas é essencial. Para minimizar o risco de contaminação por DNA no ar, as seguintes estratégias devem ser empregadas:
| 1. Estabeleça um ambiente de sala limpa A condução da produção de proteína em uma sala limpa fornece o ambiente controlado necessário para minimizar partículas transportadas pelo ar e micróbios que podem introduzir contaminação por DNA. As salas limpas devem atender a padrões de limpeza específicos para garantir uma atmosfera livre de contaminantes. | 2. Implementar sistemas de filtragem HEPA Sistemas de purificação de ar equipados com filtros HEPA são essenciais para capturar partículas transportadas pelo ar, incluindo poeira, contaminantes microbianos e fragmentos de DNA. Esses filtros ajudam a manter o ar limpo em toda a unidade de produção. |
| 3. Manter ambiente de pressão positiva Ambientes de pressão positiva impedem a entrada de ar contaminado de fora do espaço controlado. Manter uma pressão de ar mais alta dentro da área de produção em comparação a ambientes externos garante que qualquer vazamento leve à fuga de ar, não à sua intrusão. | 4. Protocolos de limpeza e desinfecção de rotina A limpeza regular da área de produção usando desinfetantes apropriados — como nucleases ou limpadores à base de cloro — pode degradar o DNA transportado pelo ar, reduzindo o risco de contaminação. Isso é especialmente importante em áreas de alto contato e em superfícies próximas a equipamentos de produção de proteína. |
| 5. Limitar a movimentação de pessoal Minimizar a movimentação de pessoal dentro de ambientes de sala limpa reduz o potencial de introdução de contaminantes por meio de interação humana. O pessoal designado deve seguir protocolos rigorosos quanto à entrada e saída para controlar a exposição. | 6. Monitoramento da Qualidade do Ar Monitorar a qualidade do ar dentro da sala limpa, incluindo contagens microbianas e níveis de partículas, é essencial para garantir a conformidade contínua com os padrões de produção. Amostradores de ar e contadores de partículas podem ser empregados para avaliar a limpeza do ambiente. |
| 7. Adote materiais de uso único O uso de consumíveis de uso único para produção de proteínas reduz significativamente o risco de contaminação cruzada, o que é comum em equipamentos reutilizáveis. | 8. Processos de Produção Fechados Sistemas fechados, como biorreatores ou câmaras seladas, minimizam a exposição ao ambiente aberto. Isso reduz o risco de contaminação de DNA pelo ar, particularmente durante estágios críticos como fermentação e purificação de proteínas. |
| 9. Evite a geração de aerossóis A formação de aerossóis durante a produção de proteínas pode facilitar a disseminação de DNA transportado pelo ar. Medidas de precaução, como manuseio cuidadoso e transferência de líquidos sem agitação, podem minimizar a formação de aerossóis. | 10. Uso de Nucleases Tratar superfícies e equipamentos com nucleases antes e depois do uso pode degradar o DNA residual que pode ser deixado após processos como lise celular ou filtração. |
| 11. Implementar isolamento ambiental Para operações de alto risco, como purificação e formulação de proteínas, o uso de isoladores ou caixas de luvas oferece uma camada extra de proteção, isolando o processo de contaminantes transportados pelo ar. | 12. Equipamentos e ferramentas dedicados Utilizar equipamentos dedicados exclusivamente para produção de proteínas evita a contaminação cruzada de ferramentas e instrumentos que podem ter sido expostos ao DNA ou ácidos nucleicos em outros processos. |
| 13. Plano de Resposta à Contaminação de Emergência Um plano de resposta eficaz deve estar em vigor para gerenciar a contaminação acidental de DNA. O protocolo deve incluir etapas rápidas de identificação, contenção e remediação para evitar a disseminação e minimizar o impacto da contaminação. | 14. Treinamento de funcionários O treinamento contínuo do pessoal sobre os riscos de contaminação por DNA e a importância das técnicas adequadas de manuseio garante a implementação das melhores práticas e a adesão aos protocolos de controle de contaminação. |
II. Removendo contaminação de DNA de proteínas
Durante a purificação de proteínas, remover qualquer contaminação residual de DNA é essencial para manter a qualidade da proteína. Várias técnicas são comumente usadas para eliminar DNA de amostras de proteínas:
| 1. Métodos de lise celular suave Tampões de lise não destrutivos permitem a liberação de proteínas enquanto minimizam a quebra do DNA. Essa abordagem evita a destruição indiscriminada do DNA, reduzindo a probabilidade de contaminação da amostra de proteína. | 2. Condições de Lise Otimizadas Ajustar fatores como pH e força iônica durante a lise celular pode impedir que o DNA se solubilize, reduzindo assim a quantidade de DNA contaminante na amostra resultante. |
| 3. Inibição de nuclease O uso de inibidores de protease, como o fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF), pode prevenir a atividade de nucleases dentro das células, permitindo uma degradação mais controlada e seletiva do DNA durante a lise. | 4. Choque Osmótico Choque osmótico é um método suave para lisar células colocando-as em uma solução com uma diferença repentina na pressão osmótica. Isso pode ajudar a reduzir a liberação de DNA, levando a preparações de proteína mais limpas. |
| 5. Lise Enzimática Usar enzimas como a lisozima para degradar as paredes celulares bacterianas é um método controlado de lise que tem como alvo apenas a membrana celular, reduzindo o risco de contaminação do DNA durante a liberação do conteúdo celular. | 6. Tratamento Pós-Lise Depois que as células são lisadas, o resfriamento imediato da amostra pode ajudar a reduzir a atividade da nuclease, o que, de outra forma, levaria a uma maior degradação do DNA na solução. |
III. Métodos avançados para remoção de ácido nucleico
Utilizar cromatografia ou métodos baseados em afinidade no processamento posterior pode remover ainda mais contaminantes de DNA residual de preparações de proteínas. A cromatografia de troca aniônica e de troca catiônica são duas técnicas bem estabelecidas para remover contaminação de DNA de amostras de proteína. Ambas dependem da interação entre ácidos nucleicos e superfícies carregadas para remover DNA seletivamente.
| 1. Colunas de troca aniônica Colunas de troca aniônica usam fases estacionárias carregadas positivamente para atrair e ligar ácidos nucleicos carregados negativamente. Ao ajustar a concentração de sal do tampão de eluição, os ácidos nucleicos podem ser removidos seletivamente da preparação de proteína. | 2. Colunas de troca catiônica Em condições específicas, colunas de troca catiônica também podem ser usadas para remover ácidos nucleicos. Ao aumentar a concentração de sal ou modificar o pH, os ácidos nucleicos podem ser eluídos competitivamente da coluna. |
| 3. Ultrafiltração A ultrafiltração usa filtragem seletiva de membrana para separar proteínas de ácidos nucleicos, garantindo que o DNA seja efetivamente removido durante as etapas de purificação. | 4. Cromatografia de filtração em gel A filtração em gel é uma técnica de cromatografia de exclusão de tamanho que separa moléculas com base em seu tamanho. Os ácidos nucleicos, sendo maiores que as proteínas, são efetivamente separados, deixando amostras de proteína pura para trás. |
4. Reduzindo a contaminação de DNA do pessoal
O pessoal desempenha um papel significativo na potencial introdução de contaminação de DNA em processos de produção de proteína. As seguintes medidas podem ajudar a mitigar esse risco:
| 1. Treinamento abrangente de pessoal Todos os funcionários devem passar por treinamento sobre a importância do controle de contaminação por DNA e melhores práticas para prevenir a contaminação. | 2. Equipamento de Proteção Individual (EPI) O pessoal deve usar EPI apropriado, como jalecos, luvas, máscaras e óculos de proteção, para minimizar o risco de contaminação por DNA pelo contato humano. |
| 3. Protocolos de Higiene das Mãos A lavagem frequente das mãos e o uso de desinfetantes à base de álcool são essenciais para reduzir a transferência de DNA das mãos para superfícies e equipamentos. | 4. Mudanças em roupas e calçados Trocar roupas e calçados de trabalho específicos garante que a contaminação por DNA não seja introduzida de fora da área de produção. |
| 5. Regulamentos rigorosos de comportamento no trabalho Os funcionários devem evitar comer, beber ou falar na área de produção de proteínas para evitar a introdução de DNA por meio de saliva, partículas de alimentos ou gotículas. | 6. Monitoramento Ambiental O monitoramento ambiental regular, incluindo verificações do ar, da superfície e do equipamento, deve ser realizado para garantir que não haja contaminação por DNA na área de produção. |
Conclusão
Para garantir a produção de proteínas de alta qualidade e não contaminadas, é necessária uma abordagem abrangente ao controle da contaminação do DNA.Ao adotar controles ambientais rigorosos, empregar métodos de purificação otimizados e enfatizar o treinamento de pessoal, os riscos associados à contaminação de DNA podem ser significativamente minimizados. Essas práticas são cruciais para manter a integridade e a confiabilidade dos produtos proteicos em pesquisas e aplicações industriais, contribuindo, em última análise, para o avanço do desenvolvimento de produtos biológicos.
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1. UCF.ME Uracil DNA Glicosilase (UDG/UNG), termolábil
2. Inibidor de RNase murina UCF.ME
Vantagens do produto
- Resíduo ultrabaixo de UCF.ME—resíduo de DNA genômico de E. coli <0,1 cópias/ U;
- Baixo resíduo de nuclease — Nenhuma exonuclease residual, enzima de corte ou RNase;
- Forte capacidade de digestão — 0,05 U/T pode digerir 105 cópias/T de produtos dU-DNA;
- Boa termolabilidade — Inativação completa sob qualquer condição de 50°C por 10 minutos, 55°C por 5 minutos ou 95°C por 5 minutos;
- Compatível com sistemas de reação RT-qPCR — Sem impacto no sistema de detecção, mesmo em altos níveis de entrada (sistema de reação 2U/20μL).
（1）Nucleases residuais baixas: sem exonucleases residuais, enzimas de corte ou RNases
Figura 1. Resultados do teste de resíduos de nuclease
（2）Resíduo de DNA genômico de E. coli < 0,1 cópias/ U
Figura 2. Resultados do teste de resíduos de DNA genômico de E. coli
Informações para pedidos
| Gato: | Nome | Aplicativo |
| 14321 | Hieff UNICON UCF. ME™ Advanced Hotstart Taq DNA Polimerase | PCR |
| 14608 | Hifair UCF.ME™ V Transcriptase Reversa (200 U/μL) | RT-PCR |
| UCF.ME™ Uracil DNA Glicosilase (UDG/UNG), lábil ao calor, 1 U/μL | RT-PCR | |
| Universidade Federal do Rio de Janeiro.Inibidor de RNase murina ME™ (40 U/µL) | RT-PCR | |
| Kit de sonda RT-qPCR Multiplex One Step Hifair™ V2 (UDG Plus, GC enhancer plus) | RT-PCR | |
| Kit de síntese de ds-cDNA Hieff NGS™ | mNGS | |
| 13501 | Kit de síntese Hieff NGS™ ds-cDNA (digestor de gDNA plus) | mNGS |
| Kit de preparação de biblioteca de DNA Flash Hieff NGS™ OnePot | mNGS | |
| 13490 | Kit de preparação de biblioteca de DNA Hieff NGS™ OnePot ll para Illumina | mNGS |
| 12946 | 10x Hieff NGS™ 1º kit de síntese de cDNA | tNGS para patógenos |
| Kit 4x Hieff™ Multiplex RT-PCR | tNGS para patógenos | |
| 4x Hieff™ Multiplex PCR Master Mix | NGS para patógenos | |
| 12977 | 4x Hieff™ Multiplex PCR Master Mix 2.0 | NGS para patógenos |