Микоплазмы, также известные как плевропневмония-подобные организмы (PPLO), являются самыми маленькими и простыми прокариотами, обнаруженными до сих пор, у которых отсутствует клеточная стенка. Они имеют диаметр от 0,1 до 0,3 мкм, могут проходить через фильтры и проявляют высокий плеоморфизм. Они являются относительно распространенными и труднообнаруживаемыми бактериальными загрязнителями в культурах клеток млекопитающих
Загрязнение микоплазмой имеет множественные неблагоприятные эффекты на клеточные культуры и стало серьезной проблемой в практике культивирования клеток. По консервативным оценкам, уровень загрязнения микоплазмой в обычных клеточных культурах составляет от 15% до 35%, что серьезно подрывает достоверность экспериментальных результатов.
Приблизительно 95% случаев заражения микоплазмой в клеточных культурах в первую очередь вызвано Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma arginini, Mycoplasma orale, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma hominis и Mycoplasma hyorhinis. На питательных средах колонии микоплазмы образуют вид «жареного яйца». Супернатанты клеточных культур и клеточные мембраны обеспечивают подходящую среду для роста микоплазм, а микоплазмы, паразитирующие на поверхности клеток, могут проникать через мембрану клетки-хозяина.
Основными источниками заражения микоплазмой являются: среда для культивирования клеток или ее компоненты (например, сырье для среды, сыворотка и другие реагенты), персонал лаборатории, инкубаторы для культивирования клеток, емкости для хранения жидкого азота, частицы и аэрозоли в воздухе, чрезмерное использование антибиотиков, неправильно запечатанные клеточные культуры и клетки, которые уже заражены микоплазмой.
Между тем, соответствующие опасности этих загрязнений включают: приведение к отбраковке партии клеточных продуктов или продуктов, произведенных с использованием клеток в качестве среды, из-за невозможности эффективно удалить микоплазму во время последующей очистки; загрязнение всего соответствующего оборудования и объектов, а также промежуточных или конечных продуктов, которые контактируют с загрязненным материалом; приведение к загрязнению других нормальных клеток микоплазмой; приведение к отбраковке важных клеточных или вирусных посевных банков из-за загрязнения микоплазмой; вынуждают лабораторию останавливать производство или экспериментальные операции для решения проблемы загрязнения микоплазмой; приведение к развитию резистентности микоплазмы, что еще больше затрудняет ее устранение; расширение области загрязнения микоплазмой; и создание угрозы для других клеточных культур в лаборатории.
Поэтому необходимо проводить регулярные проверки на наличие микоплазмы и ее удаление, чтобы гарантировать отсутствие микоплазмы в системе культивирования клеток, что необходимо для нормального хода научных исследований.
Микоплазма Обнаружение
Микоплазма — относительно распространенный, но обычно трудноудаляемый тип загрязнения. Для биологических процессов, связанных с культивированием клеток, правила требуют, чтобы «не было никакого загрязнения микоплазмой».
- В издании Китайской фармакопеи 2020 года, том III «Подготовка и контроль качества субстратов животных клеток для производства и испытания биологических продуктов», указано, что для клеток, используемых в производстве, тестирование на микоплазму должно проводиться на главном банке клеток (MCB), рабочем банке клеток (WCB) и клетках на завершающем этапе производства (EOPC).
- В Руководстве FDA для промышленности: Характеристика и квалификация клеточных субстратов и других биологических материалов, используемых при производстве вирусных вакцин для лечения инфекционных заболеваний, указано, что контроль микоплазмы должен осуществляться на сырье, вирусных семенах, необработанных жидкостях урожая и других подобных материалах.
- В документе ICH Q5D «Вывод и характеристика клеточных субстратов, используемых для производства биотехнологических/биологических продуктов» также упоминается, что контроль микоплазмы должен осуществляться на сырье, вирусных семенах, необработанных жидкостях урожая и других подобных материалах.
Рисунок 1. Точки тестирования на микоплазменное загрязнение, требуемые национальными и международными нормами
Традиционные методы обнаружения микоплазмы в основном включают методы культивирования и методы индикаторных клеток. Однако из-за длительных циклов обнаружения или проблем с чувствительностью этих двух методов они приводят к длительным циклам производства или выпуска продукции для предприятий. С развитием клеточной и генной терапии требования отрасли к своевременности и чувствительности обнаружения микоплазмы становятся все более строгими. Короткие сроки хранения недостаточны для поддержки таких длительных периодов обнаружения, поэтому быстрый метод NAT (тестирование нуклеиновых кислот) выделяется среди различных методов обнаружения микоплазмы.
Рисунок 2. Методы обнаружения микоплазмы, перечисленные в национальных и международных правилах
На основе NAT (методов амплификации нуклеиновых кислот) компания Yeasen разработала серию наборов для быстрого обнаружения микоплазмы, включая набор для обнаружения микоплазмы в реальном времени методом ПЦР, набор для одноэтапного обнаружения микоплазмы MycAway™ Plus-Color и набор для тестирования микоплазмы GMyc-PCR.
1.Набор для обнаружения микоплазмы методом ПЦР в реальном времениЭто продукт для быстрого качественного обнаружения потенциального заражения микоплазмой в производственном сырье, банках клеток, вирусных семенах, вирусных или клеточных жидкостях сбора и терапевтических клетках. Он в основном используется в процессах исследования, разработки, производства и выпуска биофармацевтических препаратов.
Квалификации продукта
Соблюдение нормативных требований: Проверено в соответствии с требованиями фармакопей EP2.6.7, JP G3 и USP 63, соответствует стандартам авторитетных международных организаций.
Соответствие аудиту: Производство продукции соответствует стандартам системы менеджмента качества ISO13485 и подтверждается комплексной аудиторской документацией.
Гарантия качества: Все ферментное сырье, необходимое для набора, производится самостоятельно и прошло промышленную переработку, что обеспечивает стабильные поставки.
Накопление технического опыта: Метод TaqMan имеет прочную техническую основу, а чувствительность набора может достигать 10 КОЕ/мл и ниже.
Фокус на производительности продукта: Библиотека антител фермента Taq с двойными блокирующими антителами повышает специфичность, чувствительность и стабильность набора.
Характеристики продукта
Несколько типов обнаружения: Оптимизированные зонды TaqMan способны обнаруживать до 183 видов микоплазм.
Простота использования: Общее время подготовки и тестирования образцов составляет менее 3 часов, что исключает необходимость 28-дневного ожидания, связанного с методами культивирования.
Высокая чувствительность: Предел обнаружения составляет всего 10 КОЕ/мл, что делает этот метод приемлемой альтернативой методам прямого культивирования.
Высокая специфичность: Праймеры и зонды разработаны с учетом 16S рРНК, что гарантирует отсутствие перекрестной реакции с близкородственными видами, такими как клостридии и лактобациллы.
Высокая безопасность: Положительный контроль (ПК) в наборе неинфекционен, что полностью исключает риск заражения.
Высокая помехоустойчивость: Введение внутреннего контроля (ВК) помогает исключить помехи в образцах и отклонения в подготовке реакции, эффективно предотвращая ложноотрицательные результаты.
Рисунок 3. Рабочий процесс обнаружения микоплазмы с использованием набора для обнаружения микоплазмы методом ПЦР в реальном времени
2. Набор для одноэтапного обнаружения микоплазмы MycAway™ Plus-ColorОн использует уникальную технологию изотермического усиления, предлагающую более высокую цветовую дискриминацию. Изменение от сине-фиолетового (отрицательного) до небесно-голубого (положительного) легче различить невооруженным глазом. Кроме того, он включает в себя антиконтаминационные компоненты для исключения возникновения ложных срабатываний.
Рисунок 4: Процедура обнаружения микоплазмы с использованием набора для одноэтапного обнаружения микоплазмы MycAway™ Plus-Color
3.GMyc-ПЦР Микоплазма ОбнаружениеНаборВ отличие от обычных одношаговых методов обнаружения ПЦР, количество праймеров увеличивается с одной пары до трех пар, нацеливаясь на консервативные области микоплазменной 16S и 23S рРНК для гнездовой ПЦР-амплификации. Это не только уменьшает неспецифические продукты, но и значительно повышает чувствительность продукта, позволяя обнаруживать всего лишь одну копию микоплазмы.
、
Рисунок 5. Процедура обнаружения микоплазмы с использованием набора для анализа GMyc-PCR Mycoplasma Test Kit
Удаление микоплазмы
В процессе культивирования клеток регулярное тестирование может эффективно предотвратить крупномасштабное загрязнение микоплазмой. Однако, если клетки уже загрязнены микоплазмой, с ними необходимо быстро обращаться. Лучшей практикой является стерилизация загрязненных клеток под высоким давлением, а затем их утилизация, чтобы избежать загрязнения других чистых линий клеток. Если загрязненные клетки особенно ценны и необходимо удалить загрязнение микоплазмой, для достижения этой цели можно использовать комбинацию антибиотиков. Поскольку у микоплазм отсутствует клеточная стенка, традиционные антибиотики, как правило, неэффективны против них. Поэтому выбор подходящего реагента для удаления микоплазмы имеет решающее значение.
MycAway™ Treatment (1000×) от Yeasen — это смешанный антибиотик, содержащий три компонента с антимикробным действием на микоплазму: хинолоны, производные тетрациклина и макролидные антибиотики. Этот реагент для удаления микоплазмы обеспечивает эффективное очищение от микоплазмы путем ингибирования синтеза ДНК и продукции белков, необходимых для роста микоплазмы, не нанося вреда клеткам. Он максимизирует спасение клеток и минимизирует потери из-за заражения микоплазмой.
Характеристики продукта
Низкая токсичность: Минимальная токсичность для клеток, гарантирующая отсутствие помех для последующих экспериментов с клетками, таких как трансфекция и анализ жизнеспособности.
Высокая стабильность: Реагент может храниться длительное время при температуре -20°С и сохранять свою высокую эффективность.
Простота использования: Просто добавьте продукт в зараженную микоплазмой питательную среду и инкубируйте.
Быстродействующий: «Немедленные результаты», эффект становится заметен уже через 3 дня.
Широкий спектр: Способен удалять большинство типов микоплазм, обнаруживаемых в лабораториях.
Рисунок 6.Иллюстрация теста цитотоксичности реагента для удаления микоплазмы
Профилактика микоплазмоза
В процессе культивирования клеток часто происходит заражение микоплазмой. Однако из-за его уникальных характеристик его трудно обнаружить невооруженным глазом или микроскопическим оборудованием. Поэтому особенно важно хорошо поработать над профилактикой микоплазмы. Эффективная профилактика заражения микоплазмой может быть достигнута путем добавления реагентов для профилактики микоплазмы в питательную среду.
В настоящее время микоплазма в лабораториях в основном возникает из-за: перекрестного заражения между клетками, загрязнения рабочей среды или лабораторного оборудования, ненадлежащих асептических методов экспериментаторов, загрязненных питательных сред или реагентов, а также исходных тканей или органов с заражением микоплазмой. Серия средств профилактики микоплазмы, разработанная Yeasen, отличается простотой, удобством и высокой стабильностью, что делает ее очень подходящей для профилактики микоплазмы в обычных культурах клеточных линий.
Информация о продукте
| Продукт | Номер по каталогу | Название продукта | спецификация продукта |
| Комплект для предварительной обработки образцов | 18461ES | Набор для подготовки образцов остаточной магнитной ДНК MolPure® | 25Т/100Т |
| 18467ES | Комплект для подготовки образцов MolPure® Mag48 FN | 3×16Т/ 6×16Т | |
| Инструмент для извлечения нуклеиновых кислот | 80511ES | 48-канальный автоматический экстрактор нуклеиновых кислот | 48 Канал |
|
Набор для обнаружения микоплазмы | 40619ES | Набор для обнаружения микоплазмы методом ПЦР в реальном времени MycAway® (2G)
| 25Т/100Т |
| 40612ES | Набор для одноэтапного обнаружения микоплазмы MycAway™ Plus-Color | 25Т/100Т | |
| 40601ES | 10анализов/20анализов | ||
| Реагент для удаления микоплазмы | 40607ES | 1мл/5×1мл
| |
|
Реагент для профилактики микоплазмоза | 40608ES | MycAwayТМ Профилактический (2000×) - Реагент для профилактики микоплазмоза | 1мл/5×1мл
|
| 40605ES | MycAwayТМ Спрей (готов к использованию) | 500мл/2×500мл/10×500мл
| |
| 40609ES | MycGuardТМ-1 Раствор (100×) для дезинфекции водяной бани CO2-инкубатора | 100мл | |
| 40610ES | MycGuardТМ-2 Раствор (500×), для дезинфекции обычной водяной бани | 100мл |