Introduktion till apoptos
Apoptos är ett programmerat celldödsfenomen som inträffar under utvecklingen av en cell eller när den påverkas av vissa faktorer, och som utlöses av regleringen av intracellulära gener och deras produkter. I apoptosvägen inträffar händelser i kronologisk ordning, en efter en, vilket leder till presentationen av apoptotiska vesiklar, och sedan inträffar apoptos. Apoptos spelar en avgörande roll i embryonal utveckling och morfogenes, upprätthållandet av en stabil population av normala celler i vävnader, kroppens försvar och immunsvar, cellskador orsakade av sjukdom eller berusning, åldrande och utveckling av tumörer, och har potentiellt terapeutiskt värde.
Detektionsprincip
Fördelningen av fosfolipider i normala cellmembran är asymmetrisk. fosfatidylserin (PS) ligger på cellmembranets inre yta i levande celler, och under apoptos genomgår cellmembranet en förändring och PS vänds från cellmembranets inre yta till cellmembranets yttre yta. Annexin V känner specifikt igen PS på ytan av apoptotiska celler, medan PS från levande celler är lokaliserat på den inre ytan av cellmembranet och inte kan binda specifikt till Annexin V.
PS av nekrotiska celler vänder också från den inre ytan av cellmembranet till den yttre ytan av cellmembranet, och Annexin V känner också igen PS på ytan av nekrotiska celler, så Annexin V kan inte skilja mellan nekrotiska och apoptotiska celler. Däremot kunde PI-färgämne binda till intracellulärt DNA och skilja mellan nekrotiska celler och levande celler. Cellmembranet i tidiga apoptotiska celler och levande celler är fortfarande intakt, och PI-färgämne kan inte fritt passera genom cellmembranet för att komma in i cellen och binda till DNA:t, så PI-färgämne kan inte märka apoptotiska celler och levande celler, medan PI-färgämne kan passera genom cellmembranet i de nekrotiska cellerna och binda till PI-cellens insida och DNA-viljan. avger röd fluorescens efter att ha exciterats av 488 nm-lasern, som kommer att tas emot av motsvarande kanal. Så Annexin V och PI kan användas samtidigt för att skilja mellan levande celler, tidiga apoptotiska celler och sena apoptotiska eller nekrotiska celler.
Fig. 2 Principen för Annexin V / PI-detektion
Flödescytometridetektion
Den maximala excitationsvåglängden för FITC är 488 nm, den maximala emissionsvåglängden är 525 nm, och den gröna fluorescensen för FITC detekteras i FL1-kanalen. Den maximala excitationsvåglängden för PI-DNA-komplex är 535 nm, den maximala emissionsvåglängden är 615 nm, och den röda fluorescensen av PI detekteras i FL2- eller FL3-kanalen. Analysen utfördes med mjukvara som CellQuest, och en tvåfärgad spridningsplot ritades med FITC som horisontell koordinat och PI som vertikal koordinat. I typiska experiment kan cellerna delas in i tre subpopulationer, med levande celler som endast har mycket låg intensitet bakgrundsfluorescens, tidiga apoptotiska celler som endast har stark grön fluorescens och sena apoptotiska celler som har dubbelfärgning med grön och röd fluorescens.
Fig.3 Flödescytometridetektion
Vanliga frågor
F: Kan Annexin V-apoptosanalysen tillämpas på växter eller bakterier (prokaryoter)?
S: Ja, men det är nödvändigt att förbereda protoplaster eftersom växtceller eller bakterier (prokaryoter) innehåller cellväggar. Den specifika dosen av färgningslösning behöver bara sänka cellerna, och färgningstiden är något annorlunda för olika celler.
F: Hur bedömer man resultatet av experimentet?
S: Levande celler (Annexin V-/PI-), tidiga apoptotiska celler (Annexin V+/PI-), sena apoptotiska celler och nekrotiska celler visar dubbel positivitet (Annexin V+/PI+), nakna kärnor (Annexin V-/PI+).
F: Vad är skillnaden mellan Annexin V och TUNEL?
S: Terminal deoxinukleotidyltransferas dUTP nick end-märkning (TUNEL) är en färgningsmetod som används för att identifiera intracellulära DNA-fragmenteringsställen - ett kännetecken för sen apoptos.
Annexin V-färgning känner igen de tidiga stadierna av apoptos genom att binda till PS-rester som exponeras utanför cellen på grund av förlust av cellmembranasymmetri.
F: Är det möjligt att utföra analysen med endast Annexin V-FITC utan att detektera PI?
A: Ja, det är möjligt. För speciella testprover, såsom röda blodkroppar utan kärnor, eller användning av läkemedlet Doxorubicin (Adriamycin) som interfererar med PI-detektion, är det möjligt att utföra analysen med endast Annexin V-FITC i båda fallen.
Produktdetaljer
| Produktnamn | Art.nr. | Specifikation |
| Annexin V-FITC/7-AAD Apoptos Detection Kit | 40311ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
| 40302ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| Annexin V-PE/7-AAD Apoptos Detection Kit | 40310ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
| 40303ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| Annexin V-YSFluor™ 488/7-AAD Apoptos Detection Kit | 40313ES60 | 100T |
| 40305ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| 40304ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| Annexin V-YSFluor™ 647/7-AAD Apoptosdetektionskit | 40312ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
| 40306ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| 40307ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| 40308ES20/50/60 | 20T/50T/100T |