Integrerat nukleinsyrasystem för att producera ultralegen låg DNA-molekylära enzymer

1. Skapa en renrumsmiljö

Att genomföra proteinproduktion i ett renrum ger den kontrollerade miljön som krävs för att minimera luftburna partiklar och mikrober som kan introducera DNA-kontamination. Renrum måste uppfylla specifika renlighetsstandarder för att säkerställa en föroreningsfri atmosfär.

2. Implementera HEPA-filtreringssystem

Luftreningssystem utrustade med HEPA-filter är viktiga för att fånga upp luftburna partiklar, inklusive damm, mikrobiella föroreningar och DNA-fragment. Dessa filter hjälper till att upprätthålla ren luft i hela produktionsanläggningen.

3. Upprätthålla övertrycksmiljön

Övertrycksmiljöer förhindrar att förorenad luft kommer in från utanför det kontrollerade utrymmet. Genom att upprätthålla högre lufttryck inne i produktionsområdet jämfört med externa miljöer säkerställs att eventuella läckor leder till att luft läcker ut, inte till intrång.

4. Rutinmässiga rengörings- och desinfektionsprotokoll

Regelbunden rengöring av produktionsområdet med lämpliga desinfektionsmedel – som nukleaser eller klorbaserade rengöringsmedel – kan bryta ned luftburet DNA, vilket minskar risken för kontaminering. Detta är särskilt viktigt i områden med hög beröring och på ytor i närheten av proteinproduktionsutrustning.

5. Begränsa personalrörelsen

Att minimera förflyttningen av personal i renrumsmiljöer minskar risken för att föroreningar införs via mänsklig interaktion. Utsedd personal bör följa strikta protokoll för in- och utresa för att kontrollera exponeringen.

6. Övervakning av luftkvalitet

Övervakning av luftkvaliteten i renrummet, inklusive antal mikrobiella och partikelhalter, är väsentligt för att säkerställa kontinuerlig efterlevnad av produktionsstandarder. Luftprovtagare och partikelräknare kan användas för att bedöma miljöns renhet.

7. Använd material för engångsbruk

Att använda engångsvaror för proteinproduktion minskar avsevärt risken för korskontaminering, vilket är vanligt med återanvändbar utrustning.

8. Slutna produktionsprocesser

Slutna system, såsom bioreaktorer eller slutna kammare, minimerar exponeringen för den öppna miljön. Detta minskar risken för DNA-kontamination från luften, särskilt under kritiska stadier som jäsning och proteinrening.

9. Undvik aerosolgenerering

Aerosolbildning under proteinproduktion kan underlätta spridningen av luftburet DNA. Försiktighetsåtgärder, såsom försiktig hantering och överföring av vätskor utan omrörning, kan minimera aerosolbildning.

10. Användning av nukleaser

Behandling av ytor och utrustning med nukleaser före och efter användning kan bryta ned resterande DNA som kan lämnas kvar efter processer som cellys eller filtrering.

11. Implementera miljöisolering

För högriskoperationer som proteinrening och formulering erbjuder användning av isolatorer eller handskfack ett extra lager av skydd som isolerar processen från luftburna föroreningar.

12. Dedikerad utrustning och verktyg

Att använda dedikerad utrustning som uteslutande används för proteinproduktion förhindrar korskontaminering från verktyg och instrument som kan ha exponerats för DNA eller nukleinsyror i andra processer.

13. Plan för nödkontaminering

En effektiv åtgärdsplan bör finnas på plats för att hantera oavsiktlig DNA-kontamination. Protokollet bör innehålla snabb identifiering, inneslutning och saneringssteg för att förhindra spridning och minimera påverkan av kontaminering.

14. Utbildning för anställda

Kontinuerlig utbildning av personal om risker för DNA-kontamination och vikten av korrekt hanteringsteknik säkerställer implementeringen av bästa praxis och efterlevnad av kontamineringskontrollprotokoll.

1. Mild cell lyseringsmetoder

Icke-destruktiva lysbuffertar möjliggör frisättning av proteiner samtidigt som DNA-brytningen minimeras. Detta tillvägagångssätt undviker den urskillningslösa förstörelsen av DNA, vilket minskar sannolikheten för att kontaminera proteinprovet.

2. Optimerade lyseringsförhållanden

Justering av faktorer som pH och jonstyrka under cellys kan förhindra att DNA blir solubiliserat, vilket minskar mängden kontaminerande DNA i det resulterande provet.

3. Nukleasinhibering

Användningen av proteashämmare, såsom fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), kan förhindra aktiviteten av nukleaser i celler, vilket möjliggör mer kontrollerad och selektiv DNA-nedbrytning under lysering.

4. Osmotisk chock

Osmotisk chock är en skonsam metod för att lysera celler genom att placera dem i en lösning med en plötslig skillnad i osmotiskt tryck. Detta kan bidra till att minska DNA-frisättningen, vilket leder till renare proteinberedningar.

5. Enzymatisk lysis

Att använda enzymer som lysozym för att bryta ned bakteriecellsväggar är en kontrollerad lyseringsmetod som endast riktar sig mot cellmembranet, vilket minskar risken för DNA-kontamination under frisättningen av cellulärt innehåll.

6. Post-lysbehandling

När cellerna är lyserade kan omedelbar kylning av provet hjälpa till att minska nukleasaktiviteten, vilket annars skulle leda till ytterligare DNA-nedbrytning i lösningen.

1. Anjonbyteskolonner

Anjonbytarkolonner använder positivt laddade stationära faser för att attrahera och binda negativt laddade nukleinsyror. Genom att justera elueringsbuffertens saltkoncentration kan nukleinsyror selektivt avlägsnas från proteinberedningen.

2. Katjonbyteskolumner

Under specifika förhållanden kan katjonbytarkolonner också användas för att avlägsna nukleinsyror. Genom att öka saltkoncentrationen eller modifiera pH kan nukleinsyror konkurrerande elueras från kolonnen.

3. Ultrafiltrering

Ultrafiltrering använder selektiv membranfiltrering för att separera proteiner från nukleinsyror, vilket säkerställer att DNA effektivt avlägsnas under reningsstegen.

4. Gelfiltreringskromatografi

Gelfiltrering är en storleksuteslutningskromatografiteknik som separerar molekyler baserat på deras storlek. Nukleinsyror, som är större än proteiner, separeras effektivt och lämnar rena proteinprover kvar.

1. Omfattande personalutbildning

All personal bör genomgå utbildning om vikten av kontroll av DNA-kontamination och bästa praxis för att förhindra kontaminering.

2. Personlig skyddsutrustning (PPE)

Personal bör bära lämplig personlig skyddsutrustning, såsom laboratorierockar, handskar, masker och skyddsglasögon, för att minimera risken för DNA-kontamination från mänsklig kontakt.

3. Handhygienprotokoll

Frekvent handtvätt och användning av alkoholbaserade desinfektionsmedel är avgörande för att minska överföringen av DNA från händer till ytor och utrustning.

4. Förändringar av kläder och skor

Byte till dedikerade arbetskläder och skor säkerställer att DNA-kontaminering inte införs utanför produktionsområdet.

5. Strikta arbetsbeteendebestämmelser

Personal bör avstå från att äta, dricka eller prata i proteinproduktionsområdet för att förhindra införandet av DNA via saliv, matpartiklar eller droppar.

6. Miljöövervakning

Regelbunden miljöövervakning, inklusive luft-, yt- och utrustningskontroller, bör utföras för att säkerställa att DNA-kontamination inte finns i produktionsområdet.