การปนเปื้อนของกรดนิวคลีอิกเป็นอุปสรรคสำคัญต่อความก้าวหน้าของเทคโนโลยีการวินิจฉัยระดับโมเลกุลมาอย่างยาวนาน เมื่อมีการพัฒนาวิธีการวินิจฉัยที่ละเอียดอ่อนมากขึ้น ความต้องการเอนไซม์และโปรตีนที่มีความบริสุทธิ์สูงขึ้นก็เพิ่มมากขึ้น ความท้าทายที่สำคัญอย่างหนึ่งในการผลิตโปรตีนคือการกำจัดการปนเปื้อนของกรดนิวคลีอิกอย่างมีประสิทธิภาพ การมีอยู่ของกรดนิวคลีอิกอาจส่งผลต่อการทำงานและกิจกรรมของโปรตีน ซึ่งอาจนำไปสู่ปัญหาต่างๆ เช่น การจับแบบไม่จำเพาะ การยับยั้งกิจกรรมของเอนไซม์ หรือสัญญาณพื้นหลังที่เพิ่มขึ้น ซึ่งท้ายที่สุดแล้วส่งผลต่อความแม่นยำของผลการวินิจฉัย
ดังนั้น การพัฒนากระบวนการที่มีประสิทธิภาพในการกำจัดกรดนิวคลีอิกในระหว่างการผลิตโปรตีนจึงถือเป็นสิ่งสำคัญและจำเป็น
หลังจากการวิจัยเทคโนโลยีหลายปี
กลยุทธ์ที่ครอบคลุมเพื่อป้องกันการปนเปื้อนของ DNA ในการผลิตโปรตีน
การปนเปื้อนของ DNA เป็นความท้าทายที่แพร่หลายในการผลิตผลิตภัณฑ์ทางชีวภาพ ซึ่งส่งผลกระทบอย่างมากต่อความบริสุทธิ์ คุณภาพ และความแม่นยำของผลการทดลอง การมีอยู่ของ DNA ในการเตรียมโปรตีนอาจทำให้ข้อสรุปการทดลองไม่ถูกต้อง ข้อมูลคลาดเคลื่อน และอาจเพิ่มโอกาสในการเกิดผลบวกปลอม สำหรับนักวิจัยและผู้ผลิตที่เกี่ยวข้องกับการผลิตโปรตีน การนำกลยุทธ์ที่มีประสิทธิภาพมาใช้เพื่อป้องกันและลดการปนเปื้อนของ DNA ถือเป็นสิ่งสำคัญ บทความนี้จะอธิบายวิธีหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของ DNA โดยเฉพาะการปนเปื้อนในอากาศ และอธิบายวิธีการกำจัด DNA ออกจากตัวอย่างโปรตีนอย่างมีประสิทธิภาพ
ฉัน. การป้องกันการปนเปื้อน DNA ในอากาศ
การปนเปื้อนของ DNA ในอากาศยังคงเป็นปัญหาสำคัญในการผลิตโปรตีน โดยเฉพาะในสภาพแวดล้อมที่จำเป็นต้องควบคุมจุลินทรีย์และอนุภาค เพื่อลดความเสี่ยงของการปนเปื้อนของ DNA ในอากาศ ควรใช้กลยุทธ์ต่อไปนี้:
| 1. สร้างสภาพแวดล้อมห้องสะอาด การผลิตโปรตีนในห้องปลอดเชื้อช่วยให้สามารถควบคุมสภาพแวดล้อมที่จำเป็นเพื่อลดอนุภาคและจุลินทรีย์ในอากาศที่อาจปนเปื้อน DNA ได้ ห้องปลอดเชื้อต้องเป็นไปตามมาตรฐานความสะอาดเฉพาะเพื่อให้แน่ใจว่าบรรยากาศปราศจากสารปนเปื้อน | 2. ติดตั้งระบบกรอง HEPA ระบบฟอกอากาศที่ติดตั้งตัวกรอง HEPA ถือเป็นสิ่งสำคัญในการดักจับอนุภาคในอากาศ รวมถึงฝุ่น สิ่งปนเปื้อนจากจุลินทรีย์ และชิ้นส่วน DNA ตัวกรองเหล่านี้ช่วยรักษาอากาศให้สะอาดทั่วทั้งโรงงานผลิต |
| 3. รักษาสภาพแวดล้อมที่มีแรงกดดันเชิงบวก สภาพแวดล้อมที่มีแรงดันบวกจะป้องกันไม่ให้มีอากาศปนเปื้อนเข้ามาจากภายนอกพื้นที่ควบคุม การรักษาแรงดันอากาศให้สูงกว่าภายในพื้นที่การผลิตเมื่อเทียบกับสภาพแวดล้อมภายนอกจะช่วยให้มั่นใจได้ว่าการรั่วไหลใดๆ จะนำไปสู่การที่อากาศไหลออก ไม่ใช่การรุกล้ำเข้ามาของอากาศ | 4. โปรโตคอลการทำความสะอาดและฆ่าเชื้อตามปกติ การทำความสะอาดพื้นที่การผลิตเป็นประจำโดยใช้สารฆ่าเชื้อที่เหมาะสม เช่น น้ำยาทำความสะอาดที่มีคลอรีน หรือสารทำความสะอาดที่มีส่วนผสมของสารดังกล่าว สามารถทำให้ DNA ในอากาศเสื่อมสภาพลงได้ ซึ่งจะช่วยลดความเสี่ยงของการปนเปื้อนได้ ซึ่งเป็นสิ่งสำคัญอย่างยิ่งในบริเวณที่มีการสัมผัสบ่อยครั้งและบนพื้นผิวที่อยู่ใกล้กับอุปกรณ์การผลิตโปรตีน |
| 5. จำกัดการเคลื่อนย้ายบุคลากร การลดการเคลื่อนไหวของบุคลากรภายในสภาพแวดล้อมห้องปลอดเชื้อจะช่วยลดโอกาสที่สารปนเปื้อนจะเข้าสู่ร่างกายผ่านปฏิสัมพันธ์ระหว่างมนุษย์ บุคลากรที่ได้รับมอบหมายควรปฏิบัติตามขั้นตอนการเข้าและออกอย่างเคร่งครัดเพื่อควบคุมการสัมผัส | 6. การติดตามคุณภาพอากาศ การตรวจสอบคุณภาพอากาศภายในห้องปลอดเชื้อ รวมถึงจำนวนจุลินทรีย์และระดับอนุภาค ถือเป็นสิ่งสำคัญเพื่อให้มั่นใจว่าเป็นไปตามมาตรฐานการผลิตอย่างต่อเนื่อง เครื่องเก็บตัวอย่างอากาศและเครื่องนับอนุภาคสามารถนำมาใช้เพื่อประเมินความสะอาดของสิ่งแวดล้อมได้ |
| 7. ใช้วัสดุแบบใช้ครั้งเดียวทิ้ง การใช้วัสดุสิ้นเปลืองแบบใช้ครั้งเดียวสำหรับการผลิตโปรตีนช่วยลดความเสี่ยงของการปนเปื้อนข้ามได้อย่างมาก ซึ่งมักเกิดขึ้นกับอุปกรณ์ที่นำกลับมาใช้ซ้ำได้ | 8. กระบวนการผลิตแบบปิด ระบบปิด เช่น ไบโอรีแอ็กเตอร์หรือห้องปิดผนึก ช่วยลดการสัมผัสกับสภาพแวดล้อมเปิด ซึ่งจะช่วยลดความเสี่ยงของการปนเปื้อนของ DNA จากอากาศ โดยเฉพาะในขั้นตอนที่สำคัญ เช่น การหมักและการทำให้โปรตีนบริสุทธิ์ |
| 9. หลีกเลี่ยงการเกิดละอองลอย การก่อตัวของละอองในระหว่างการผลิตโปรตีนสามารถช่วยให้ DNA ที่ฟุ้งกระจายในอากาศได้ง่ายขึ้น มาตรการป้องกัน เช่น การจัดการและถ่ายโอนของเหลวอย่างระมัดระวังโดยไม่เขย่า จะช่วยลดการก่อตัวของละอองได้ | 10. การใช้สารนิวคลีเอส การบำบัดพื้นผิวและอุปกรณ์ด้วยนิวคลีเอสก่อนและหลังใช้งานสามารถย่อยสลาย DNA ที่เหลือซึ่งอาจหลงเหลืออยู่หลังจากกระบวนการต่างๆ เช่น การแตกสลายเซลล์หรือการกรอง |
| 11. การดำเนินการแยกสิ่งแวดล้อม สำหรับการดำเนินการที่มีความเสี่ยงสูงเช่น การทำให้บริสุทธิ์และการกำหนดสูตรโปรตีน การใช้เครื่องแยกหรือกล่องแบบมีถุงมือจะช่วยเพิ่มชั้นการป้องกันพิเศษ และแยกกระบวนการจากสารปนเปื้อนในอากาศ | 12. อุปกรณ์และเครื่องมือเฉพาะทาง การใช้อุปกรณ์เฉพาะที่ใช้สำหรับการผลิตโปรตีนโดยเฉพาะจะช่วยป้องกันการปนเปื้อนข้ามจากเครื่องมือและเครื่องมือที่อาจสัมผัสกับ DNA หรือกรดนิวคลีอิกในกระบวนการอื่น |
| 13. แผนตอบสนองการปนเปื้อนฉุกเฉิน ควรมีแผนตอบสนองที่มีประสิทธิภาพเพื่อจัดการกับการปนเปื้อนของดีเอ็นเอโดยไม่ได้ตั้งใจ โปรโตคอลควรประกอบด้วยขั้นตอนการระบุ การควบคุม และการแก้ไขอย่างรวดเร็วเพื่อป้องกันการแพร่กระจายและลดผลกระทบจากการปนเปื้อนให้เหลือน้อยที่สุด | 14. การอบรมพนักงาน การฝึกอบรมบุคลากรอย่างต่อเนื่องเกี่ยวกับความเสี่ยงของการปนเปื้อนใน DNA และความสำคัญของเทคนิคการจัดการที่ถูกต้องช่วยให้มั่นใจได้ว่ามีการนำแนวทางปฏิบัติที่ดีที่สุดมาใช้และปฏิบัติตามพิธีสารการควบคุมการปนเปื้อน |
II. การกำจัดการปนเปื้อน DNA จากโปรตีน
ระหว่างการทำให้โปรตีนบริสุทธิ์ การกำจัดสิ่งปนเปื้อน DNA ที่เหลือถือเป็นสิ่งสำคัญสำหรับการรักษาคุณภาพของโปรตีน เทคนิคต่างๆ ที่ใช้กันทั่วไปในการกำจัด DNA ออกจากตัวอย่างโปรตีน ได้แก่:
| 1. วิธีการสลายเซลล์แบบอ่อน บัฟเฟอร์ไลซิสแบบไม่ทำลายช่วยให้สามารถปลดปล่อยโปรตีนได้ในขณะที่ลดการแตกของ DNA ลง วิธีนี้ช่วยหลีกเลี่ยงการทำลาย DNA อย่างไม่เลือกหน้า จึงลดโอกาสที่ตัวอย่างโปรตีนจะปนเปื้อน | 2. สภาวะการสลายไลซิสที่ได้รับการปรับให้เหมาะสม การปรับปัจจัย เช่น ค่า pH และความเข้มข้นของไอออนในระหว่างการแตกสลายของเซลล์สามารถป้องกันไม่ให้ DNA ละลายได้ ดังนั้นปริมาณ DNA ที่ปนเปื้อนในตัวอย่างที่ได้จึงลดลง |
| 3. การยับยั้งนิวคลีเอส การใช้สารยับยั้งโปรตีเอส เช่น ฟีนิลเมทิลซัลโฟนิลฟลูออไรด์ (PMSF) สามารถป้องกันการทำงานของนิวคลีเอสภายในเซลล์ ทำให้การย่อยสลาย DNA ในระหว่างการแตกสลายได้รับการควบคุมและเลือกสรรมากขึ้น | 4. ช็อกจากออสโมซิส การช็อกออสโมซิสเป็นวิธีการที่อ่อนโยนในการสลายเซลล์โดยการวางเซลล์ไว้ในสารละลายที่มีความดันออสโมซิสต่างกันอย่างกะทันหัน วิธีนี้ช่วยลดการปล่อย DNA ส่งผลให้เตรียมโปรตีนได้สะอาดขึ้น |
| 5. การสลายด้วยเอนไซม์ การใช้เอนไซม์ เช่น ไลโซไซม์ ในการย่อยสลายผนังเซลล์แบคทีเรีย ถือเป็นวิธีการไลซิสแบบควบคุมที่มุ่งเป้าไปที่เยื่อหุ้มเซลล์เท่านั้น ซึ่งจะช่วยลดความเสี่ยงของการปนเปื้อนของ DNA ในระหว่างการปล่อยเนื้อหาในเซลล์ | 6. การรักษาหลังการสลายไขมัน เมื่อเซลล์แตกสลาย การทำให้ตัวอย่างเย็นลงทันทีสามารถช่วยลดกิจกรรมของนิวคลีเอสได้ มิฉะนั้นจะนำไปสู่การย่อยสลายของ DNA เพิ่มเติมในสารละลาย |
สาม. วิธีขั้นสูงสำหรับการกำจัดกรดนิวคลีอิก
การใช้โครมาโทกราฟีหรือวิธีการที่ใช้ความสัมพันธ์ในกระบวนการปลายน้ำสามารถกำจัดสารปนเปื้อน DNA ในปริมาณเล็กน้อยจากการเตรียมโปรตีนได้เพิ่มเติม โครมาโทกราฟีแบบแลกเปลี่ยนแอนไอออนและแลกเปลี่ยนเคตไอออนเป็นเทคนิคสองแบบที่ได้รับการยอมรับในการกำจัดสิ่งปนเปื้อนของ DNA จากตัวอย่างโปรตีน ทั้งสองเทคนิคนี้อาศัยปฏิสัมพันธ์ระหว่างกรดนิวคลีอิกและพื้นผิวที่มีประจุเพื่อกำจัด DNA อย่างเลือกสรร
| 1. คอลัมน์แลกเปลี่ยนประจุลบ คอลัมน์แลกเปลี่ยนแอนไอออนใช้เฟสคงที่ที่มีประจุบวกเพื่อดึงดูดและจับกับกรดนิวคลีอิกที่มีประจุลบ โดยการปรับความเข้มข้นของเกลือในบัฟเฟอร์การชะ กรดนิวคลีอิกจะถูกกำจัดออกจากการเตรียมโปรตีนอย่างเลือกสรร | 2. คอลัมน์แลกเปลี่ยนไอออนบวก ภายใต้เงื่อนไขเฉพาะ คอลัมน์แลกเปลี่ยนไอออนบวกอาจใช้ในการกำจัดกรดนิวคลีอิกได้ด้วย โดยการเพิ่มความเข้มข้นของเกลือหรือการปรับค่า pH กรดนิวคลีอิกจะถูกชะออกจากคอลัมน์อย่างมีประสิทธิภาพ |
| 3- การกรองระดับอุลตราฟิลเตรชั่น การกรองระดับอุลตราฟิลเตรชันใช้การกรองเมมเบรนแบบเลือกเฉพาะเพื่อแยกโปรตีนออกจากกรดนิวคลีอิก ช่วยให้มั่นใจได้ว่า DNA จะถูกกำจัดออกอย่างมีประสิทธิภาพในขั้นตอนการบริสุทธิ์ | 4- การกรองเจลโครมาโตกราฟี การกรองด้วยเจลเป็นเทคนิคโครมาโตกราฟีแบบแยกตามขนาดที่แยกโมเลกุลตามขนาด กรดนิวคลีอิกมีขนาดใหญ่กว่าโปรตีน จึงแยกออกได้อย่างมีประสิทธิภาพ โดยทิ้งตัวอย่างโปรตีนบริสุทธิ์ไว้ |
สี่. การลดการปนเปื้อนของ DNA จากบุคลากร
บุคลากรมีบทบาทสำคัญในการปนเปื้อนของ DNA เข้าสู่กระบวนการผลิตโปรตีน มาตรการต่อไปนี้สามารถช่วยบรรเทาความเสี่ยงนี้ได้:
| 1. การฝึกอบรมบุคลากรอย่างครอบคลุม พนักงานทุกคนควรได้รับการฝึกอบรมเกี่ยวกับความสำคัญของการควบคุมการปนเปื้อนของ DNA และแนวทางปฏิบัติที่ดีที่สุดในการป้องกันการปนเปื้อน | 2. อุปกรณ์ป้องกันส่วนบุคคล (PPE) บุคลากรควรสวมอุปกรณ์ป้องกันส่วนบุคคล (PPE) ที่เหมาะสม เช่น เสื้อคลุมแล็บ ถุงมือ หน้ากาก และแว่นตา เพื่อลดความเสี่ยงของการปนเปื้อน DNA จากการสัมผัสของมนุษย์ |
| 3. โปรโตคอลสุขอนามัยมือ การล้างมือบ่อยๆ และการใช้เจลแอลกอฮอล์เป็นสิ่งสำคัญในการลดการถ่ายโอน DNA จากมือสู่พื้นผิวและอุปกรณ์ | 4. การเปลี่ยนแปลงด้านเครื่องแต่งกายและรองเท้า การเปลี่ยนเป็นชุดและรองเท้าสำหรับทำงานโดยเฉพาะช่วยให้มั่นใจได้ว่าไม่มีการปนเปื้อน DNA จากภายนอกพื้นที่การผลิต |
| 5. กฎระเบียบการประพฤติตนในการทำงานที่เคร่งครัด บุคลากรควรงดรับประทานอาหาร ดื่มเครื่องดื่ม หรือพูดคุยในพื้นที่ผลิตโปรตีน เพื่อป้องกันไม่ให้มีการแพร่กระจายของ DNA ผ่านทางน้ำลาย อนุภาคอาหาร หรือละอองน้ำ | 6. การติดตามตรวจสอบสิ่งแวดล้อม ควรมีการตรวจสอบสิ่งแวดล้อมเป็นประจำ รวมถึงการตรวจสอบอากาศ พื้นผิว และอุปกรณ์ เพื่อให้แน่ใจว่าไม่มีการปนเปื้อนของ DNA ในพื้นที่การผลิต |
บทสรุป
เพื่อให้แน่ใจว่าผลิตโปรตีนคุณภาพสูงที่ไม่มีการปนเปื้อน จำเป็นต้องใช้แนวทางแบบครอบคลุมในการควบคุมการปนเปื้อนของ DNAการใช้มาตรการควบคุมสิ่งแวดล้อมที่เข้มงวด การใช้กรรมวิธีทำให้บริสุทธิ์ที่เหมาะสม และการเน้นการฝึกอบรมบุคลากร จะทำให้ความเสี่ยงที่เกี่ยวข้องกับการปนเปื้อนของ DNA ลดลงได้อย่างมาก แนวทางปฏิบัตินี้มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการรักษาความสมบูรณ์และความน่าเชื่อถือของผลิตภัณฑ์โปรตีนในการวิจัยและการใช้งานในอุตสาหกรรม ซึ่งท้ายที่สุดแล้วจะช่วยให้การพัฒนาผลิตภัณฑ์ทางชีวภาพก้าวหน้าขึ้น
สินค้าที่เกี่ยวข้อง
1. UCF.ME ยูราซิลดีเอ็นเอไกลโคซิเลส (UDG/UNG) ไม่เสถียรต่อความร้อน
2. สารยับยั้ง RNase ของหนู UCF.ME
ข้อดีของผลิตภัณฑ์
- สารตกค้างของดีเอ็นเอจีโนม UCF.ME—E. coli ที่ต่ำเป็นพิเศษ <0.1 สำเนา/หน่วย
- ปริมาณนิวคลีเอสตกค้างต่ำ—ไม่มีเอ็กโซนิวคลีเอสตกค้าง เอนไซม์ไนไตรต์ หรือ RNase
- ความสามารถในการย่อยที่แข็งแกร่ง—0.05 U/T สามารถย่อยผลิตภัณฑ์ dU-DNA ได้ 105 สำเนา/T
- การทนความร้อนได้ดี—การทำให้ไม่ทำงานอย่างสมบูรณ์ภายใต้สภาวะใดๆ ก็ตามที่อุณหภูมิ 50°C เป็นเวลา 10 นาที 55°C เป็นเวลา 5 นาที หรือ 95°C เป็นเวลา 5 นาที
- เข้ากันได้กับระบบปฏิกิริยา RT-qPCR—ไม่มีผลกระทบต่อระบบการตรวจจับแม้ในระดับอินพุตสูง (ระบบปฏิกิริยา 2U/20μL)
（1）นิวคลีเอสตกค้างต่ำ: ไม่มีเอ็กโซนิวคลีเอสตกค้าง เอ็นไซม์นิคกิ้ง หรือ RNases
รูปที่ 1 ผลการทดสอบสารตกค้างนิวคลีเอส
（2）ปริมาณดีเอ็นเอตกค้างของ E. coli < 0.1 สำเนา/หน่วย
รูปที่ 2. ผลการทดสอบสารตกค้างดีเอ็นเอของอีโคไล
ข้อมูลการสั่งซื้อ
| แมว: | ชื่อ | แอปพลิเคชัน |
| ไฮเอฟ UNICON UCF. ME™ ขั้นสูง Hotstart Taq DNA โพลิเมอเรส | พีซีอาร์ | |
| 14608 | เอนไซม์ไฮแฟร์ UCF.ME™ V รีเวิร์สทรานสคริปเทส (200 U/μL) | การตรวจด้วยวิธีอาร์ที-พีซีอาร์ |
| UCF.ME™ ยูราซิลดีเอ็นเอไกลโคซิเลส (UDG/UNG) ไม่เสถียรต่อความร้อน 1 U/μL | การตรวจด้วยวิธีอาร์ที-พีซีอาร์ | |
| ยูซีเอฟสารยับยั้ง RNase ของหนู ME™ (40 U/µL) | การตรวจด้วยวิธีอาร์ที-พีซีอาร์ | |
| ชุดตรวจ RT-qPCR แบบมัลติเพล็กซ์ขั้นตอนเดียว Hifair™ V2 (UDG Plus, GC enhancer plus) | การตรวจด้วยวิธีอาร์ที-พีซีอาร์ | |
| Hieff Unicon® Pure Pro U+ qPCR Mix (หนึ่งหลอด) | คิวพีซีอาร์ | |
| ชุดสังเคราะห์ ds-cDNA ของ Hieff NGS™ | เอ็มเอ็นจีเอส | |
| 13501 | ชุดสังเคราะห์ Hieff NGS™ ds-cDNA (gDNA digester plus) | เอ็มเอ็นจีเอส |
| ชุดเตรียมไลบรารี DNA แฟลช OnePot ของ Hieff NGS™ | เอ็มเอ็นจีเอส | |
| 13490 | ชุดเตรียมไลบรารี DNA OnePot ll ของ Hieff NGS™ สำหรับ Illumina | เอ็มเอ็นจีเอส |
| 12946 | ชุดสังเคราะห์ cDNA Hieff NGS™ 1st 10x | tNGS สำหรับเชื้อก่อโรค |
| ชุด RT-PCR มัลติเพล็กซ์ Hieff™ 4x | tNGS สำหรับเชื้อก่อโรค | |
| มาสเตอร์มิกซ์มัลติเพล็กซ์ PCR Hieff™ 4x | NGS สำหรับเชื้อโรค | |
| 12977 | มาสเตอร์มิกซ์ 2.0 มัลติเพล็กซ์ Hieff™ 4x | NGS สำหรับเชื้อโรค |
| ชุดตรวจหาสารตกค้าง DNA ของเซลล์โฮสต์ E.coli (2G) | คิวซี | |
| ชุดเตรียมตัวอย่าง DNA ตกค้างแม่เหล็ก MolPure™ | คิวซี |