Tổng quan về T4 DNA Ligase
Các nhà khoa học sử dụng loại enzyme nào để liên kết một gen mới? Không cần phải nói, DNA ligase cũng có trong đó. Vậy tại sao DNA ligase lại quan trọng đến vậy trong DNA tái tổ hợp? Bởi vì DNA ligase chịu trách nhiệm liên kết đoạn mục tiêu với vector, đây là một trong những yếu tố chính quyết định sự thành công của thí nghiệm. Là một loại DNA ligase, T4 DNA ligase đóng vai trò gì trong các thí nghiệm nhân bản phân tử? Nó hoạt động như thế nào? Tiếp theo, chúng ta sẽ giới thiệu kỹ lưỡng về T4 DNA ligase.
1. T4 DNA Ligase là gì?
2. Chức năng của T4 DNA ligase là gì?
3.
4. Hướng dẫn lựa chọn cho
1. T4 DNA Ligase là gì?
T4 DNA ligase là một ligase phụ thuộc ATP xúc tác phản ứng nối giữa các phân tử DNA. Nó chủ yếu tạo thành phosphodiester bằng cách liên kết các đầu 3'-hydroxyl và 5'-phosphate. DNA ligase tham gia vào quá trình sao chép và sửa chữa DNA trong tất cả các sinh vật. T4 DNA ligase được mã hóa bởi phage được sản xuất trong quá trình nhiễm phage T4 của E. coli.
Các ligase được sử dụng trong kỹ thuật di truyền chủ yếu là E. coli DNA ligase và T4 DNA ligase, loại sau hiện đang được sử dụng rộng rãi hơn. T4 DNA ligase có thể sửa chữa các vết cắt mạch đơn trên DNA mạch đôi, RNA mạch đôi hoặc các mạch lai DNA/RNA để kết nối hai nucleotide liền kề và đóng vai trò quan trọng trong việc sửa chữa và tái tổ hợp DNA.
Trong quá trình xây dựng plasmid tái tổ hợp, T4 DNA ligase có thể được sử dụng cùng với enzyme hạn chế để hoàn thành thí nghiệm xây dựng plasmid tái tổ hợp. Nó có thể xúc tác sự hình thành liên kết phosphodiester giữa đầu 5'-P và đầu 3'-OH của DNA sợi đôi và có hiệu quả kết nối tốt đối với kết nối đầu dính và kết nối đầu tù.
Hình 1. Cơ chế ligase DNA T4
2. Chức năng của T4 DNA ligase là gì?
2.1 Xây dựng vectơ
Trong các thí nghiệm xây dựng vector, các enzyme hạn chế khác nhau có thể tạo ra các loại đầu khác nhau. Đối với các đầu khác nhau, T4 DNA ligase sẽ có các chiến lược liên kết khác nhau.
2.1.1 Nhân bản bằng enzyme hạn chế, đầu dính được tạo ra bởi quá trình tiêu hóa đơn
Trong quá trình xây dựng vectơ, nếu cùng một endonuclease hạn chế được sử dụng để cắt đoạn DNA của gen mục tiêu và phân tử vectơ có thể tạo ra cùng một đầu dính, thì T4 DNA ligase có thể trực tiếp thực hiện kết nối tái tổ hợp. Tuy nhiên, vì các đầu dính giống nhau, nên gen mục tiêu có thể được đưa vào vectơ theo hướng thuận hoặc ngược, điều này sẽ dễ dàng làm tăng khối lượng công việc sàng lọc để tìm các bản sao tái tổ hợp chính xác. Hãy cân nhắc sử dụng phương pháp tiêu hóa enzyme kép để xây dựng vectơ.
Ngoài ra, các đầu kết dính của vectơ được chuẩn bị bởi quá trình tiêu hóa bằng một enzyme cũng có thể được ghép nối, và sau đó các liên kết phosphodiester được hình thành giữa các nucleotide dưới tác động của T4 DNA ligase, dẫn đến sự tự liên kết của vectơ. Sử dụng phosphatase kiềm để xử lý vectơ đã tiêu hóa có thể loại bỏ nhóm phosphate ở đầu 5' của vectơ để vectơ không thể hoàn thành quá trình tự liên kết. Do đó, dưới tác động của T4 DNA ligase, vectơ và đoạn đích được kết nối để hoàn thành quá trình xây dựng vectơ tái tổ hợp.
2.1.2 Nhân bản bằng enzyme hạn chế, đầu dính được tạo ra bởi quá trình tiêu hóa kép
Trong quá trình xây dựng vectơ, nếu hai enzyme hạn chế có đầu dính khác nhau được sử dụng để tiêu hóa đoạn mục tiêu và vectơ tương ứng, hai đầu dính khác nhau có thể được tạo ra. Tại thời điểm này, T4 DNA ligase có thể liên kết chọn lọc các đầu dính giống nhau để đảm bảo rằng đoạn mục tiêu được đưa vào vectơ theo đúng hướng. Khi đoạn mục tiêu và vectơ trong Hình 2 được tiêu hóa bằng EcoR I và BamH I cùng một lúc, các đầu dính giống nhau có thể được kết nối. Chỉ có một hướng liên kết giữa đoạn mục tiêu và vectơ.
Hình 2. Sự thắt chặt đầu dính được tạo ra bởi quá trình tiêu hóa bằng enzyme kép[1]
2.1.3 Sao chép các đoạn giới hạn, đầu tù
Một số endonuclease hạn chế cũng có thể tạo ra các đầu tù trong quá trình cắt bằng enzym, chẳng hạn như Sma I và các loại khác. T4 DNA ligase có thể trực tiếp tạo liên kết phosphodiester giữa vectơ và phần chèn, và không cần ghép cặp giữa các bazơ. Tuy nhiên, phương pháp này có hiệu quả gắn kết thấp và dễ bị vectơ tự gắn kết. Nhìn chung, các đầu tù có thể được chuyển đổi thành các đầu dính và sau đó được gắn kết. Ví dụ, thêm các bazơ poly A và poly T bổ sung vào các đầu của đoạn đích và vectơ và các đầu bổ sung dính nhân tạo tương ứng sẽ cải thiện hiệu quả kết nối bằng terminal deoxynucleotidyl transferase.
2.1.4 Nhân bản TA
Vectơ T được sử dụng trong nhân bản TA có phần nhô ra T ở đầu 3'. Khi trình tự DNA của đoạn mục tiêu không rõ ràng, đoạn gen mục tiêu có thể được kết nối với vectơ T bằng cách nhân bản TA và gen mục tiêu có thể được xác định bằng cách giải trình tự. Taq DNA polymerase được sử dụng trong PCR có hoạt động transferase đầu cuối và có thể thêm một nucleotide "A" vào đầu 3' của đoạn DNA. T4 DNA ligase có thể kết nối trực tiếp sản phẩm được khuếch đại bởi Taq DNA polymerase với vectơ T và sản phẩm được khuếch đại PCR có thể đạt được mục đích nhân bản hiệu quả mà không cần thêm bộ điều hợp nhân tạo.
Hình 3. Quy trình làm việc của nhân bản TA[2]
2.2 Thắt ống dẫn NGS
Trong quá trình xây dựng thư viện giải trình tự thế hệ tiếp theo, cần phải kết nối bộ điều hợp nhân tạo với sản phẩm PCR trước khi có thể cố định nó trên tế bào dòng chảy trên chip giải trình tự để hoàn tất giải trình tự. Xây dựng thư viện liên kết nối ghép nối TA là một phương tiện kỹ thuật rất phổ biến và nguyên lý của nó tương tự như quá trình nhân bản TA đã đề cập ở trên. Sau khi đoạn DNA cần giải trình tự được phosphoryl hóa ở đầu 5' và "A" được thêm vào đầu 3', nó sẽ bổ sung và ghép nối với bộ điều hợp có đầu dính "T". Sau đó, toàn bộ sợi đôi được hình thành và giải trình tự bằng máy.
Trong quá trình gắn TA, các loại mẫu khác nhau hoặc độ phức tạp của cấu trúc mảnh axit nucleic sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình gắn, do đó bộ điều hợp của các nền tảng khác nhau cũng sẽ có tác động đến kết quả thư viện cuối cùng.
Ví dụ, bộ điều hợp Bubble của nền tảng MGI có cấu trúc thứ cấp đặc biệt và yêu cầu hiệu quả liên kết rất cao đối với T4 DNA ligase, việc giảm hiệu quả liên kết sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến đầu ra của thư viện.
Hình 4. Quy trình thắt ống dẫn chung
3. Yeasen Biotech T4 DNA ligase có thể được sử dụng để gắn bộ chuyển đổi NGS
3.1 Yeasen Biotech Fast T4 DNA ligase có hiệu suất gắn kết cực cao
Sử dụng
Hình 5. Các loại sản phẩm liên kết khác nhau được phát hiện bởi Agilent 2100
3.2 Yeasen Biotech Fast T4 DNA ligase có năng suất thư viện tuyệt vời
So với các ligase DNA T4 khác, khi sử dụng Fast T4 DNA ligase cho các loại xây dựng thư viện khác nhau, năng suất thư viện sẽ tốt hơn.
Bảng 1. Các thư viện tạo ra các loại mẫu khác nhau
| Các loại mẫu | Hệ vi khuẩn đường ruột gDNA | cfDNA | FFPE HD200 gDNA | |||
| T4 ADN ligase (cùng đơn vị) | | N* | | N* | | N* |
| Đầu vào DNA (ng) | 10 | 10 | 50 | |||
| Số chu kỳ khuếch đại | 10 | 10 | 8 | |||
| Năng suất trung bình (μg) Nền tảng Illumina | 3.3 | 2.8 | 2.7 | 2.2 | 3 | 2,5 |
| Năng suất trung bình (μg) Nền tảng MGI | 2.7 | 0,9 | 2.0 | 0.7 | 2.3 | 0,8 |
4. Hướng dẫn lựa chọn cho Yeasen Biotech T4 DNA ligase
Bảng 2: Sản phẩm liên quan
| Vị trí sản phẩm | Tên sản phẩm | Con mèo# | Ứng dụng |
| Phổ quát | Hieff™ Gold T4 DNA Ligase(Hỏi thăm) | 10300ES | Nhân bản phân tử. |
| Phổ quát | 10301ES | Xây dựng thư viện NGS. | |
| Hiệu quả gắn kết cao và ít vật chủ E. coli dư lượng | 10299ES | Xây dựng thư viện NGS, đặc biệt phù hợp để phát hiện tác nhân gây bệnh, phát hiện NIPT, v.v. | |
| Độ nhạy cao | 10298ES | Xây dựng thư viện NGS, đặc biệt phù hợp cho việc xây dựng thư viện các mẫu cfDNA. |
Tài liệu tham khảo
[1] W. Yuan. Kỹ thuật gen [M]. Nhà xuất bản Công nghiệp hóa chất, 2019.
[2] Clark DP, Pazdernik NJ, Mcgehee M R. Nhân bản gen cho sinh học tổng hợp - ScienceDirect[J]. Sinh học phân tử (Phiên bản thứ ba), 2019:199-239.
[3] Tomkinson AE, Vijayakumar S, Pascal JM, et al. DNA Ligases: Cấu trúc, Cơ chế phản ứng và Chức năng[J]. Chemical Reviews, 2006, 106(2):687-699.
[4] Shuman S. DNA Ligases: Tiến trình và triển vọng[J]. Tạp chí Hóa học Sinh học, 2009, 284(26):17365-17369.