Integreret nukleinsyrefjernelsessystem til produktion af ultra-rent lavt DNA-molekylær enzymer

1. Etabler et renrumsmiljø

Udførelse af proteinproduktion i et renrum giver det kontrollerede miljø, der er nødvendigt for at minimere luftbårne partikler og mikrober, der kan introducere DNA-kontamination. Renrum skal opfylde specifikke renlighedsstandarder for at sikre en forureningsfri atmosfære.

2. Implementer HEPA-filtreringssystemer

Luftrensningssystemer udstyret med HEPA-filtre er afgørende for at fange luftbårne partikler, herunder støv, mikrobielle forurenende stoffer og DNA-fragmenter. Disse filtre hjælper med at opretholde ren luft i hele produktionsanlægget.

3. Oprethold et miljø med positivt tryk

Overtryksmiljøer forhindrer indtrængen af ​​forurenet luft uden for det kontrollerede rum. Opretholdelse af højere lufttryk inde i produktionsområdet sammenlignet med eksterne miljøer sikrer, at eventuelle utætheder fører til udslip af luft, ikke indtrængen.

4. Rutinemæssige rengørings- og desinfektionsprotokoller

Regelmæssig rengøring af produktionsområdet ved hjælp af passende desinfektionsmidler – såsom nukleaser eller klorbaserede rengøringsmidler – kan nedbryde luftbårent DNA, hvilket reducerer risikoen for kontaminering. Dette er især vigtigt i områder med høj berøring og på overflader i nærheden af ​​udstyr til proteinproduktion.

5. Begræns personalebevægelser

Minimering af personalebevægelser i renrumsmiljøer reducerer potentialet for at indføre forurenende stoffer via menneskelig interaktion. Udpeget personale bør følge strenge protokoller vedrørende ind- og udrejse for at kontrollere eksponeringen.

6. Overvågning af luftkvalitet

Overvågning af luftkvaliteten i renrummet, herunder mikrobielle tal og partikelniveauer, er afgørende for at sikre løbende overholdelse af produktionsstandarder. Luftprøvetagere og partikeltællere kan bruges til at vurdere miljøets renhed.

7. Brug materialer til engangsbrug

Brug af engangsforbrugsvarer til proteinproduktion reducerer risikoen for krydskontaminering betydeligt, hvilket er almindeligt med genanvendeligt udstyr.

8. Lukkede produktionsprocesser

Lukkede systemer, såsom bioreaktorer eller lukkede kamre, minimerer eksponeringen for det åbne miljø. Dette reducerer risikoen for DNA-kontamination fra luften, især under kritiske stadier som fermentering og proteinrensning.

9. Undgå aerosolgenerering

Aerosoldannelse under proteinproduktion kan lette spredningen af ​​luftbårent DNA. Sikkerhedsforanstaltninger, såsom forsigtig håndtering og overførsel af væsker uden omrøring, kan minimere aerosoldannelse.

10. Brug af nukleaser

Behandling af overflader og udstyr med nukleaser før og efter brug kan nedbryde resterende DNA, der kan efterlades efter processer som cellelyse eller filtrering.

11. Implementer miljøisolering

Til højrisikooperationer som proteinrensning og formulering giver brug af isolatorer eller handskebokse et ekstra lag af beskyttelse, der isolerer processen fra luftbårne forurenende stoffer.

12. Dedikeret udstyr og værktøj

Anvendelse af dedikeret udstyr, der udelukkende bruges til proteinproduktion, forhindrer krydskontaminering fra værktøjer og instrumenter, der kunne have været udsat for DNA eller nukleinsyrer i andre processer.

13. Nødkontamineringsplan

En effektiv indsatsplan bør være på plads til at håndtere utilsigtet DNA-kontaminering. Protokollen bør omfatte hurtige identifikations-, indeslutnings- og afhjælpningstrin for at forhindre spredning og minimere virkningen af ​​kontaminering.

14. Uddannelse af medarbejdere

Kontinuerlig træning af personalet om DNA-kontamineringsrisici og vigtigheden af ​​korrekte håndteringsteknikker sikrer implementering af bedste praksis og overholdelse af kontamineringskontrolprotokoller.

1. Mild cellelysemetoder

Ikke-destruktive lysisbuffere muliggør frigivelse af proteiner, mens nedbrydningen af ​​DNA minimeres. Denne fremgangsmåde undgår vilkårlig ødelæggelse af DNA, hvilket reducerer sandsynligheden for at kontaminere proteinprøven.

2. Optimerede lysisforhold

Justering af faktorer som pH og ionstyrke under cellelyse kan forhindre DNA i at blive solubiliseret og dermed reducere mængden af ​​kontaminerende DNA i den resulterende prøve.

3. Nukleasehæmning

Anvendelsen af ​​proteaseinhibitorer, såsom phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), kan forhindre aktiviteten af ​​nukleaser i celler, hvilket muliggør mere kontrolleret og selektiv DNA-nedbrydning under lysis.

4. Osmotisk stød

Osmotisk shock er en skånsom metode til at lysere celler ved at placere dem i en opløsning med en pludselig forskel i osmotisk tryk. Dette kan hjælpe med at reducere DNA-frigivelsen, hvilket fører til renere proteinpræparater.

5. Enzymatisk lysis

Brug af enzymer som lysozym til at nedbryde bakterielle cellevægge er en kontrolleret metode til lysering, der kun retter sig mod cellemembranen, hvilket reducerer risikoen for DNA-kontamination under frigivelsen af ​​cellulært indhold.

6. Post-lysis behandling

Når først celler er lyseret, kan øjeblikkelig afkøling af prøven hjælpe med at reducere nukleaseaktivitet, hvilket ellers ville føre til yderligere DNA-nedbrydning i opløsningen.

1. Anionbytterkolonner

Anionbytterkolonner bruger positivt ladede stationære faser til at tiltrække og binde negativt ladede nukleinsyrer. Ved at justere elueringsbufferens saltkoncentration kan nukleinsyrer selektivt fjernes fra proteinpræparatet.

2. Kationbytterkolonner

Under specifikke betingelser kan kationbytterkolonner også anvendes til at fjerne nukleinsyrer. Ved at øge saltkoncentrationen eller modificere pH kan nukleinsyrer konkurrerende elueres fra søjlen.

3. Ultrafiltrering

Ultrafiltrering bruger selektiv membranfiltrering til at adskille proteiner fra nukleinsyrer, hvilket sikrer, at DNA effektivt fjernes under oprensningstrin.

4. Gelfiltreringskromatografi

Gelfiltrering er en størrelsesudelukkende kromatografiteknik, der adskiller molekyler baseret på deres størrelse. Nukleinsyrer, der er større end proteiner, adskilles effektivt og efterlader rene proteinprøver.

1. Omfattende personaleuddannelse

Alt personale bør gennemgå uddannelse i vigtigheden af ​​kontrol med DNA-kontaminering og bedste praksis for at forebygge kontaminering.

2. Personligt beskyttelsesudstyr (PPE)

Personale bør bære passende PPE, såsom laboratoriefrakker, handsker, masker og beskyttelsesbriller, for at minimere risikoen for DNA-kontaminering fra menneskelig kontakt.

3. Håndhygiejneprotokoller

Hyppig håndvask og brug af alkoholbaserede desinfektionsmidler er afgørende for at reducere overførslen af ​​DNA fra hænder til overflader og udstyr.

4. Ændringer i tøj og fodtøj

Skift til dedikeret arbejdstøj og fodtøj sikrer, at DNA-forurening ikke indføres uden for produktionsområdet.

5. Strenge regler for arbejdsadfærd

Personale bør afholde sig fra at spise, drikke eller tale i proteinproduktionsområdet for at forhindre introduktion af DNA via spyt, madpartikler eller dråber.

6. Miljøovervågning

Regelmæssig miljøovervågning, herunder luft-, overflade- og udstyrskontrol, bør udføres for at sikre, at der ikke er DNA-kontamination i produktionsområdet.