Hintergrund – Was ist ROS
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind ein normales Produkt des Zellstoffwechsels – ein sauerstoffhaltiges bioaktives Molekül, zu dem Peroxid, Superoxid, Hydroxylradikal, Singulett-Sauerstoff und α-Sauerstoff usw. gehören, die eine wichtige regulatorische Rolle in zellulären Signalwegen und der Transkription spielen, wie etwa bei Apoptose, Autophagie, Alterung, Krebs usw.
Einfluss der ROS-Konzentration auf Zellen – warum ROS nachweisen?
Bei niedrigen Konzentrationen reaktiver Sauerstoffspezies sind ROS als „Redox-Botenstoffe“ an der intrazellulären Signalgebung und Regulierung beteiligt. Unter Umweltbelastungen (z. B. ionisierende Strahlung, Hitzeeinwirkung, ultraviolette Strahlen, Hypoxie usw.) steigen die ROS-Konzentrationen jedoch dramatisch an, was zu DNA-Schäden führen, die Genexpression hemmen, zu Proteinfehlfaltungen führen und sogar die Proteinsynthese beeinträchtigen kann, was zu schweren Schäden an Zellstrukturen führt, was als oxidativer Stress bezeichnet wird.
Sobald die ROS-Werte die Kapazität der endogenen antioxidativen Abwehrkräfte überschreiten, wird das Redoxgleichgewicht gestört, was zu strukturellen oder konformationellen Veränderungen in DNA, Lipiden, Proteinen und letztendlich zum Zelltod führt.
Der ROS-Spiegel ist ein wichtiges Signal für Zellschäden, die durch normale physiologische Funktionen und Umweltfaktoren verursacht werden. Die Erkennung des intrazellulären ROS-Spiegels ist von großer Bedeutung für das Verständnis der Signalwege und potenziellen Wirkmechanismen einiger Arzneimittel. Daher spielt die Auswahl geeigneter Sonden zur Erkennung von ROS eine wichtige Rolle bei der Erforschung von Krankheitsmechanismen und beim Arzneimittelscreening.
Wie funktioniert die ROS-Erkennung?
Der Testkit für reaktive Sauerstoffspezies (CAT# 50101ES01) ist die am häufigsten verwendete Methode zur Quantifizierung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies-Werte basierend auf Änderungen der Fluoreszenzintensität des Fluoreszenzfarbstoffs DCFH-DA (2,7-Dichlordihydrofluoresceindiacetat).
DCFH-DA selbst hat keine Fluoreszenz und kann ungehindert die Zellmembran passieren. Nach dem Eintritt in die Zelle kann es durch intrazelluläre Esterasen hydrolysiert werden, um DCFH zu produzieren. DCFH kann jedoch nicht in die Zellmembran eindringen, sodass die Sonde leicht markiert und in der Zelle aggregiert werden kann. Intrazelluläre reaktive Sauerstoffspezies können nicht fluoreszierendes DCFH oxidieren und fluoreszierendes DCF bilden. Die Intensität der grünen Fluoreszenz von DCF ist direkt proportional zum Gehalt an intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies, und der Gehalt an intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies kann durch Nachweis der Fluoreszenz von DCF ermittelt werden.
Unter den Bedingungen einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von 525 nm wurde die DCF-Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzmikroskop, einem Laser-Konfokalmikroskop, einem Fluoreszenzspektrophotometer, einem Fluoreszenz-Mikroplattenlesegerät, einem Durchflusszytometer usw. erfasst, um den Gehalt intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies zu bestimmen.
Von Kunden, die dieses Produkt verwenden, veröffentlichte Literatur (einige Beispiele)
Bis September 2022 wurden im ROS Reactive Oxygen Species Detection Kit (50101ES01) insgesamt 164 Artikel mit einem Gesamt-Impact-Faktor von 913,72 veröffentlicht.
Auswirkungen der ROS-Produktion auf die Makrophagenpolarisation und die Abtötung von Tumorzellen (PMID: 35665496; PMID: 35301299; PMCID: PMC8931093PMCID: PMC9353410.
Häufig gestellte Fragen
F1: Welche Proben eignen sich für ROS-Tests?
A1: Es wird im Allgemeinen zum Nachweis von Säugetierzellen verwendet und ist nur zum Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies in lebenden Zellen oder in vivo geeignet.
F2: Ist das ROS-Testkit für die Erkennung in Serum oder Plasma geeignet?
A2: Nicht geeignet für den Nachweis von ROS in Serum oder Gewebehomogenat. Es können aus frischem Gewebe hergestellte Einzelzellsuspensionen ausprobiert werden.
F3: Können Pflanzen oder Bakterien erkannt werden?
A3: Es ist nur für den Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies in lebenden Zellen oder in vivo geeignet, da die Halbwertszeit von Hydroxylradikalen und Superoxidradikalen von Sauerstoff sehr kurz ist und es nur für den Nachweis lebender Zellen geeignet ist. Pflanzen oder Bakterien, die nach der Vorbereitung von Protoplasten zum Nachweis verwendet werden können, können mit diesem Kit ROS in vivo nicht nachgewiesen werden.
F4: Wie kann ich einen übermäßigen Fluoreszenzhintergrund vermeiden?
A4: Achten Sie nach der Inkubation der Sonde darauf, alle verbleibenden Sonden wegzuspülen, die nicht in die Zelle gelangt sind.
F5: Kann ich die Menge an ROS in normalen Zellen feststellen?
A5: Der Gehalt an reaktiven Sauerstoffspezies in normalen Zellen ist sehr gering und der Nachweiseffekt ist möglicherweise nicht sehr gut.
F6: Die negativen und positiven Fluoreszenzwerte sind gleich, was ist los?
A6: Dies kann daran liegen, dass die Konzentration der hinzugefügten Sonde zu hoch ist. Es wird empfohlen, die Sondenkonzentration um 5–7,5 μM zu reduzieren und die Inkubationszeit auf 15–20 Minuten zu verlängern.
F7: Die Fluoreszenz der positiven Kontrolle ist schwach. Was ist los?
A7: Die positive Kontrolle Rosup war normalerweise auf 100 μM konzentriert, und 30 Minuten bis 4 Stunden nach der Stimulation wurde ein signifikanter Anstieg der reaktiven Sauerstoffspezies beobachtet. Die Wirkung der positiven Kontrolle der reaktiven Sauerstoffspezies kann zwischen verschiedenen Zellen stark variieren. Wenn der Anstieg der ROS nicht innerhalb von 30 Minuten nach der Stimulation beobachtet wird, kann die Induktionszeit verlängert oder die Konzentration von Rosup entsprechend erhöht werden.
A8: Dieselbe Sonde, nicht geteilt, die ersten 5 Male war die Wirkung sehr gut, dieses Mal ist sie nicht gefärbt, was ist los?
F8: 1. Der Zellzustand ist nicht gut, was zu einer geringen Färbeeffizienz führt; 2. Die Induktionszeit des positiven Arzneimittels ist zu kurz und der Gehalt an reaktiven Sauerstoffspezies kann durch Inkubation bei 37 °C im Dunkeln für 30 min-4 h deutlich erhöht werden; 3. Die Sonde wurde mehr als 4 Mal eingefroren und aufgetaut, die Färbeeffizienz ist reduziert und das Fluoreszenzsignal ist instabil (manchmal stark, manchmal schwach und leicht zu löschen). Es wird empfohlen, die Sonden in Aliquots aufzuteilen und in einem lichtgeschützten Gefrierschrank bei -20 °C aufzubewahren, um wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen zu vermeiden.
F9: Welche Instrumente können zum Testen verwendet werden?
A9: Fluoreszenzmikroskop, Laser-Konfokalmikroskop, Fluoreszenzspektrophotometer, Fluoreszenz-Mikroplattenlesegerät, Durchflusszytometer usw. können Fluoreszenzwerte erkennen.
Von Kunden, die dieses Produkt verwenden, veröffentlichte wissenschaftliche Forschungspublikationen (teilweise)
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[2] Zhang M, et al. Einberufung von Immunzellen durch lichtaktivierbares, silencing NK-abgeleitetes Exosom (LASNEO) zur synergetischen Tumorausrottung. Adv Sci (Weinh). 2022 Aug;9(22): e2201135. doi: 10.1002/advs.202201135. Epub 2022 Jun 4. IF: 16.806
[3] Zhang D, et al. Orale Mikroträger auf Mikroalgenbasis für die Homöostase der Darmmikrobiota und den Darmschutz bei Krebs Strahlentherapie. Nat Commun. 2022 Mar 17;13(1):1413. doi: 10.1038/s41467-022-28744-4. PMID: 35301299. WENN: 14.919
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[6] Yang C, et al. Photodynamische und photothermische Therapie bei Nierenzellkarzinomen mittels rotphosphorbeschichteten TiO2-Nanostäben. Small. 2021 Jul;17(30): e2101837. doi: 10.1002/smll.202101837. Epub 2021 Jun 19. PMID: 34145768. WENN: 13.281
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