Desoxyribonuklease I (DNase I) ist eine Endonuklease, die nicht nur zur Aufrechterhaltung der RNA-Integrität verwendet wird, sondern auch zur DNA-Footprint-Analyse, zur Generierung zufälliger DNA-Bibliotheken, zur Verringerung der Klebrigkeit in Zelllysaten oder Proteinextrakten usw. Kurz gesagt kann DNase I in fast allen Anwendungen eingesetzt werden, die eine enzymatische Spaltung von DNA erfordern. Im Folgenden finden Sie eine detaillierte Einführung in DNase I und ihre spezifische Anwendung.

1. Was ist DNase I?
2. DNase I zur Herstellung der DNA-freien RNA-Extraktion
3. DNase I für die In-vitro-Transkription zur Entfernung der Template-DNA
4. DNase I zur rRNA-Entfernung
5. DNase I zur DNA-Markierung
6. Andere Anwendungen
7. Leitfaden zur DNase I-Produktauswahl

1. Was ist DNase I?

Desoxyribonuklease I (DNase I) ist eine unspezifische Endonuklease, die einzel- oder doppelsträngige DNA verdauen kann, die in verschiedenen Geweben und Körperflüssigkeiten vorkommt. Sie kann Phosphodiesterbindungen hydrolysieren, um Mono- und Oligodesoxynukleotide zu produzieren, die eine 5'-Phosphatgruppe und eine 3'-OH-Gruppe enthalten. Der optimale pH-Arbeitsbereich von DNase I liegt bei 7-8, ihre Aktivität hängt von Ca2+ ab und kann durch zweiwertige Metallionen wie Mn2+, Mg2+, Zn2+ usw. aktiviert werden. In Gegenwart von Mg2+ schert DNase I zufällig jede Stelle doppelsträngiger DNA; in Gegenwart von Mn2+ kann DNase I doppelsträngige DNA an derselben Stelle scheren, um ein stumpfes Ende oder einen Überhang mit 1-2 Nukleotiden langen klebrigen Enden zu bilden.

Abbildung 1. Schematische Darstellung der Spaltung von dsDNA durch DNase I in Gegenwart von Mg2+ und Mn2+.

Obwohl DNase I-Spaltungen im Allgemeinen als unspezifische Spaltungen gelten, wirkt DNase I eher auf bestimmte Sequenzfragmente, wie etwa die Minor-Furch-Region, und neigt eher zu Spaltungen von Purin-Pyrimidin-Sequenzen. Wenn DNase I jedoch auf heterogene dsDNA einwirkt, werden alle vier Basen gespalten, und die Wirkung auf eine bestimmte Base ist nicht mehr als dreimal größer als die auf andere Basen.

2. DNase I zur Herstellung der DNA-freien RNA-Extraktion

Bei biologischen Experimenten besteht der erste Schritt darin, Nukleinsäure vorzubereiten, um verschiedene Funktionen von RNA zu untersuchen. Da DNA und RNA jedoch während des Zelllyseprozesses häufig gemeinsam freigesetzt werden, lässt sich die Interferenz zwischen beiden nicht vermeiden, egal welche Extraktionslösung verwendet wird. Daher müssen spezielle Enzyme verwendet werden, um die Interferenz zu beseitigen. Für eine qualitativ hochwertige RNA-Extraktion wird DNase I verwendet, um restliche DNA aus der Probe zu entfernen.

DNase I kann doppelsträngige und einzelsträngige DNA zu Oligonukleotiden und Einzelnukleotiden abbauen, und die DNA im RNA-Präparationsprodukt kann effektiv abgebaut werden. DNase I wird dann durch Erhitzen mit einem Stopppuffer inaktiviert. Während des Erhitzungsprozesses kann die Haarnadelstruktur des RNA-Moleküls geöffnet werden, was den direkten Eintritt der RNA in den Reverse-Transkriptionsprozess erleichtert.
Die Qualität der RNA hat einen großen direkten Einfluss auf die experimentellen Daten. Im Allgemeinen können gDNA-Rückstände während der RNA-Extraktion nicht vollständig vermieden werden. Daher wird im Allgemeinen empfohlen, RNA-Proben mit DNase I zu behandeln, um restliche gDNA zu verdauen, bevor sie in nachgelagerte Anwendungen (z. B. mRNA-Expressionsanalyse, Transkriptomanalyse usw.) überführt werden. Der Schritt des Verdauens von gDNA kann während der RNA-Extraktion, nach der RNA-Extraktion oder vor der Reverse-Transkription von RNA durchgeführt werden.Entsprechend der Produktpositionierung sind die von Yeasen bereitgestellten Produkte wie folgt:

Tabelle 1: Liste der Produkte zur DNA-Entfernung bei der RNA-Extraktion oder vor der Reversen Transkription

3. DNase I für die In-vitro-Transkription zur Entfernung der Template-DNA

Bei der In-vitro-Transkription (IVT) wird hauptsächlich DNA als Vorlage sowie entsprechende Substrate und Puffer verwendet, um durch In-vitro-Transkription RNA zu erhalten. Bei In-vitro-Transkriptionsexperimenten werden häufig RNA-Polymerasen wie T7, T3 und SP6 zur RNA-Synthese verwendet. Die synthetisierte RNA kann DNA-Reste enthalten. Die Beseitigung der DNA-Reste ist für die Entwicklung nachfolgender Experimente von Vorteil. Beispielsweise ist in der Entwicklungsphase eines mRNA-Impfstoffs die Entfernung von Resten ein entscheidender Schritt, der die Schwierigkeit der nachfolgenden Reinigung verringern und die Reinheit des Produkts erhöhen kann. Die DNA-Vorlage wird normalerweise mithilfe von rekombinanter DNase I (RNase-frei) entfernt.Gemäß dem mRNA-Syntheseprozess sind die von Yeasen bereitgestellten Produkte wie folgt: