Wenn es um Telomere und Protelomerase geht in der Biologie denken die Menschen oft zuerst an das Altern, ein unvermeidliches Naturphänomen. Telomere Ist repetitive DNA-Sequenzen an den Enden eukaryotischer Chromosomen, die die Verantwortung für die Aufrechterhaltung der Chromosomenintegrität und die Regulierung des Zellteilungszyklus.
Protelomerase ist ein Reverse-Transkriptase-DNA-Synthese-Enzym, das Telomere verlängert. Es ist ein Nukleoprotein, das aus RNA und Proteinen besteht. Die Proteinkomponente kann die Synthese von Telomer-Wiederholungssequenzen katalysieren mit der RNA-Komponente.
Abbildung 1. Mechanismus der Protelomerase-vermittelten Telomerverlängerung[1]
Protelomerase kann Telomere reparieren und verlängern, Defekte bei der DNA-Replikation ausgleichen, den Verlust von Telomeren während der Zellteilung verhindern und die Anzahl der Zellteilungen erhöhen. 2009 wurde der Nobelpreis für Physiologie oder Medizin an Elizabeth H. Blackburn, Carol W. Greider und Jack W. Szostak für ihre herausragenden Beiträge zur Aufdeckung der entscheidenden Rolle von Telomeren und Protelomerasen verliehen. in der Zellfunktion und Alterung.
Heute möchte ich Ihnen eine einzigartige Protelomerase vorstellen: TelN proProtelomerase. TelN Protelomerase stammt vom Bakteriophagen N15 und ist Bestandteil des N15-Replikationssystems. bei der Erzeugung linearer Prophagen-DNA. Im Gegensatz zu Protelomerase Bei Eukaryoten ist TelN ein reines Proteinenzym ohne RNA-Komponenten. Es besitzt Spaltungs-Ligations- Aktivität und hinterlässt nach dem Schneiden doppelsträngiger DNA (dsDNA) ein kovalent geschlossenes Ende an der Spaltstelle.
Abbildung 2. TelN-Protelomerase Spaltstelle
TelN-Protelomerase Wirkmechanismus
Die Erkennungsstelle der TelN-Protelomerase ist eine 56 bp lange Palindromsequenz mit telR und telL auf beiden Seiten. Die zentrale Position der Zielsequenz ist ebenfalls eine Palindromsequenz telO. TelN Protelomerase spaltet innerhalb der telO-Sequenz und bildet an den beiden Spaltungsenden eine kovalent geschlossene Haarnadelstruktur. Das Ende der DNA nach der Verdauung besteht immer noch aus telR und telL, was als Hundeknochen DNA (dbDNA).
Abbildung 3. Protelomerase Spaltungsmechanismus an der TelN-Stelle[2]
Aufgrund der speziellen enzymatischen Spaltungs-Ligationsaktivität der TelN-Protelomerase kann zirkuläre Plasmid-DNA durch eine einstufige enzymatische Reaktion in lineare, kovalent geschlossene hantelförmige Moleküle umgewandelt werden. Im Vergleich zu linearen offenen DNA-Molekülen weist lineare geschlossene DNA ein höheres Proteinexpressionsniveau in Zellen auf, was sich sehr gut für die Konstruktion linearer Mini-DNA mit geschlossenen Enden mit hoher Stabilität und minimaler Fremdsequenz eignet. Plasmid-DNA spielt eine wichtige Rolle als Kernelement von mRNA-Impfstoffen, DNA-Impfstoffen und Zellgentherapien. Die traditionelle Plasmidproduktionsmethode umfasst die Fermentation mit Escherichia coli und mehrstufige Amplifikation, und das unkontrollierbare Risiko im Fermentationsprozess begrenzt die Ausbeute an hochwertigem Plasmid, was der Schlüssel zur Begrenzung der Produktionskapazität von Impfstoffen ist. Das britische Unternehmen Touchlight hat eine innovative dbDNA-Technologie auf den Markt gebracht. Diese Technologie durchbricht die traditionelle Methode der bakteriellen Fermentation zur Herstellung von Plasmid-DNA und verwendet stattdessen eine enzymatische DNA-Synthese in vitro. Die spezielle enzymatische Spaltungs-Ligationsaktivität der TelN-Protelomerase wird auch verwendet, um bei der obigen Methode lineare Mini-DNA mit geschlossenen Enden zu erzeugen.
Anwendung der TelN-Protelomerase in der DNA-Enzymsynthese
Die enzymatische In-vitro-DNA-Methode auf Basis von Phi29-DNA-Polymerase und TelN-Protelomerase kann viele unkontrollierbare Risiken im biologischen Fermentationsprozess vermeiden, und die enzymatische In-vitro-Methode kann DNA schnell und mit hoher Ausbeute synthetisieren. Die synthetisierte DNA kann in vielen neuen Technologien verwendet werden, wie z. B. mRNA-Impfstoff, DNA-Impfstoff, Gentherapie-Vektor und Gen-Editierung.
Abbildung 4. Flussdiagramm der DNA-Enzymsynthese[3]
Enzymatischer DNA-Syntheseprozess
- Denaturierung der Vorlage
Die zirkuläre Plasmid-DNA-Vorlage wird durch einen Denaturierungsprozess in zwei einzelsträngige zirkuläre DNAs umgewandelt.
- Rolling-Circle-Verstärkung
Die Rolling-Circle-Amplifikation wurde mithilfe der Phi29-DNA-Polymerase und einzelsträngiger zirkulärer DNA durchgeführt, um lange lineare doppelsträngige konkatemere DNA mit Protelomerase-Erkennungssequenzintervallen zu erzeugen.
- Schneiden und kovalenter Verschluss
TelN-Protelomerase erkennt das TelRL auf der DNA von Telomerkomplexen und führt Spaltungs-Ligationsaktivitäten durch, um lineare, kovalent verbundene DNA-Monomere zu erzeugen.
- Entfernung der bakteriellen Rückgrat-DNA
Restriktionsendonukleasen oder Exonukleasen bauen die DNA des Bakterienskeletts mit einer offenen Struktur am Ende ab, um DNA zu erhalten, die nur die Zielgenexpressionselemente enthält. Die enzymatische Synthese der DNA-Technologie umgeht die biologische Fermentation und kann schnell eine Plasmid-DNA-Synthese auf GMP-Niveau erreichen, wodurch die Produktionskapazitätsbeschränkungen in den Bereichen Gentherapie und mRNA-Impfstoffe gelöst werden. Sie birgt ein enormes Potenzial für die Industrialisierung. Um die Entwicklung der DNA-Enzymsynthesetechnologie zu fördern, kann YEASEN Biology Kernenzymmaterialien für die DNA-Enzymsynthese bereitstellen, wie etwa phi29-DNA-Polymerase (14404ES) und TelN-Protelomerase (14540ES), um die Forschung und Produktion der DNA-Enzymsynthesetechnologie zu unterstützen.
PLeistungspräsentation von YEASEN TelN-Protelomerase
- Die Spaltungs- und Ligationsleistung ist ausgezeichnet und mit der von importierten Marken vergleichbar.
Unter Verwendung eines superspiralisierten Plasmids, das die TelN-Protelomerase-Erkennungsstelle als Vorlage enthält, wurde das Gradientenadditionsenzym (0,078-5 U) von YEASEN und der Marke A hinzugefügt. 0,5 μg des superspiralisierten Plasmids wurden in geschlossene lineare doppelsträngige DNA (dsDNA) umgewandelt. Die Umwandlungseffizienz wurde mittels Gelelektrophorese ermittelt und die Ergebnisse zeigten, dass die Spaltungs- und Ligationsaktivität der TelN-Protelomerase von YEASEN der der Marke A entsprach.
Abbildung 5. Nachweis der Protelomerase-Spaltungsaktivität von TelN M:Marker, C: superspiralisierte Plasmidkontrolle
- Die Verschlussintegrität linearer dsDNA > 90%
Unter Verwendung des superspiralisierten Plasmids, das die TelN-Protelomerase-Erkennungsstelle als Vorlage enthält, Hinzufügen von TelN-Protelomerase von YEASEN und Marke A, Umwandeln von 0,5 μg superspiralisiertem Plasmid in geschlossene lineare dsDNA und Hinzufügen von T5-Exonuklease, um seine Endintegrität durch den Grad der Bandenverschlechterung festzustellen. Die Ergebnisse zeigten, dass die durch die TleN-Protelomerase von YEASEN erzeugte dsDNA-Endverschlussintegrität > 90 % betrug, was der von Marke A entsprach.
Abbildung 6. Integritätstest des Endverschlusses der TelN-Protelomerase. C1: Plasmid mit TelN-Erkennungsstelle, ohne TelN-Protelomerase; C2: Plasmid mit TelN-Erkennungsstelle, TelN-Protelomerase, ohne T5-Exonuklease; Plasmid: Plasmid mit TelN-Erkennungsstelle.
Verwandte Produkte von DNA-Enzymsynthese
| Produktklassifizierung | Produktname | Katalog-Nr. |
| Protelomerase | 14540ES | |
| Phi29 DNA-Polymerase | 14404ES | |
| Exonuklease | Exonuklease III | 14525ES |
| 14538ES | ||
| dNTP | 10125ES |
RReferenzen
[1] Giardini MA, Segatto M, da Silva MS, Nunes VS, Cano MI. Telomere und Protelomerase Biologie. Prog Mol Biol Transl Sci. 2014;125:1-40.
[2] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. Lineare geschlossene Mini-DNA, die durch das prokaryotische Spalt- und Verbindungsenzym TelN erzeugt wird, ist in Säugetierzellen funktionsfähig. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654.
[3] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. Lineare geschlossene Mini-DNA, die durch das prokaryotische Spalt- und Verbindungsenzym TelN erzeugt wird, ist in Säugetierzellen funktionsfähig. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654. doi:10.1007/s00109-002-0362-2.