Mit der rasanten Entwicklung der Glykoproteomik und der Antikörper-Wirkstoffforschung hat auch die Glykosylierungsmodifikation viel Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Der Kontakt zwischen Zellen und zwischen Zellen und zwischen Zellen und Krankheitserregern wird hauptsächlich durch die Wechselwirkung von Zuckern und Proteinen hergestellt, und die Glykosylierung bestimmt die Adhäsionseigenschaften von Glykokonjugaten. Bei IgG ist die konservierte N-Glykosylierung an Asn297 in der Fc-Region ebenfalls entscheidend für seine Aktivität. Darüber hinaus verfügen einige Antikörper auch über zusätzliche N-Glykane, die zusammen mit der konservierten Stelle an Asn297 in der Fc-Region die Erkennung, Halbwertszeit und Immunantwort des Antikörpers beeinflussen.
Die Proteinglykosylierung ist eine komplexe posttranslationale Modifikation, bei der Glykanketten an bestimmten Stellen von Proteinen verbunden werden. Je nach Art der Glykankette werden Glykoproteine in N-gebundene Glykoproteine, O-gebundene Glykoproteine usw. unterteilt. Darüber hinaus wird die Proteinglykosylierung auch vom Wirtszelltyp und den Fermentationsbedingungen (wie Kulturmedium, pH-Wert, Temperatur usw.) beeinflusst. Daher weisen Glykoproteine normalerweise heterogene Glykosylierungsmuster auf, einschließlich Glykosylierungsstellen, Glykosylierungsniveaus und der spezifischen Struktur der Glykanketten, was die Analyse und strukturelle Charakterisierung von Glykanketten äußerst anspruchsvoll macht. Um möglichst viele strukturelle Informationen über Glykanketten zu erhalten, besteht die Hauptstrategie der Glykankettenanalyse darin, zuerst die Glykanketten von den Proteinen freizusetzen und dann eine detaillierte Analyse und Charakterisierung durchzuführen. Bei dieser Strategie ist eine effiziente, genaue und stabile Deglykosylierungsmethode von entscheidender Bedeutung.
Zur Deglykosylierung werden heute häufig enzymatische Methoden eingesetzt.
Glykoproteine können anhand ihrer Glykankettentypen in N- und O-gebundene Glykopeptide eingeteilt werden. Zu den für N-gebundene Glykopeptide häufig verwendeten Enzymen gehören Peptid-N-Glykosidase F (PNGase F), Endoglykosidase H (Endo H) und Endoglykosidase S (Endo S). PNGase F hydrolysiert die GlcNAc-Asn-Bindung und kann Glykanketten mit hohem Mannosegehalt, komplexe und hybride Glykanketten entfernen. Endo H spaltet glykosidische Bindungen innerhalb des Pentasaccharidkerns der N-Glykankette. Endo S spaltet speziell N-gebundene Glykane vom Chitobiosekern der schweren Kette von nativem IgG.
Abbildung 1. Schnittstelle von PNGase F, Endo H und Endo S.
Unter ihnen PNGase F ist die effektivste enzymatische Methode zur Entfernung fast aller N-gebundenen Oligosaccharide in Glykoproteinen, die durch Asparagin verbundene Oligosaccharid-Glykoproteine mit hohem Mannose-Gehalt, Hybrid- und komplexe Oligosaccharid-Glykoproteine spalten können, wobei N-gebundene Glykane spezifisch entfernt werden. Die Spaltstelle ist: die Amidbindung zwischen dem innersten N-Acetylglucosamin (GlcNAc) und dem Asparaginrest, wobei das Asparagin auf dem Protein nach enzymatischer Hydrolyse in Asparaginsäure umgewandelt wird.
Wenn sich α1-6-Fucose am GlcNAc-Kern befindet, kann PNGase F auch schneiden; nur wenn sich α1-3-Fucose am GlcNAc-Kern befindet (häufig bei Pflanzen- und Insekten-Glykoproteinen), kann PNGase F nicht schneiden.
Die herkömmliche PNGase F-Enzymreaktion benötigt jedoch mehrere Stunden, um Antikörper-N-Glycane freizusetzen. Aufgrund der bevorzugten Glykanfreisetzung kann eine unvollständige Deglykosylierung zu verzerrten Ergebnissen führen, und die erhaltene Glykanverteilung stellt möglicherweise nicht die richtige Zusammensetzung der therapeutischen Antikörper dar. Daher ist die möglichst schnelle Erstellung eines genauen N-Glycan-Profils für die Überwachung der Glykosylierung während des Produktionsprozesses von Antikörpern und Antikörperfusionsproteinen sowie anderen biotherapeutischen Wirkstoffen von entscheidender Bedeutung.
Schnelle PNGase F
Fast PNGase F ist ein optimiertes rekombinantes Reagenz, das Antikörper, Immunglobuline, Fusionsproteine und andere Glykoproteine in wenigen Minuten schnell und vollständig deglykosylieren kann. Dieses Enzym kann schnell und ohne Vorliebe alle N-Glykane entfernen und kann direkt für die nachfolgende Chromatographie oder Massenspektrometrieanalyse verwendet werden.
Produkteigenschaften:
Schnell: Vollständige und schnelle Deglykosylierung in wenigen Minuten.
Hohe Reinheit: Keine Protease- oder Glykosidase-Kontamination, Reinheit ≥ 95 %.
Nicht selektiv: Entfernen Sie schnell und ohne Vorliebe alle N-Glycane.
Gute Kompatibilität: Direkte Verwendung für die nachfolgende Chromatographie- oder Massenspektrometrieanalyse.
Testdaten:
Einstufige Protein-Deglykosylierung:
- 10 µg Substrat/100 µg Antikörper und ddH2O gemischt zu einem Gesamtvolumen von 16 µl;
- 4 μl schnellen PNGase F-Puffer (5x) hinzufügen, Endvolumen 20 μl;
- Fügen Sie 1 μL Fast PNGase F hinzu.
- 10 Minuten bei 50 °C inkubieren.
Abbildung 2. Einstufiger enzymatischer Spaltungseffekt auf Proteinsubstrat (A) und Antikörper (B).
1: Proteinmarker (Kat.-Nr. 20350ES) 2: Konkurrent + Substrat oder Antikörper 3: Konkurrent + Substrat oder Antikörper 4:
Zweistufige Protein-Deglykosylierung:
- 10 µg Substrat/100 µg Antikörper und ddH2O gemischt zu einem Gesamtvolumen von 16 µl;
- 4 μl schnellen PNGase F-Puffer (5x) hinzufügen, Endvolumen 20 μl;
- 2 Minuten bei 80 °C inkubieren, auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
- Fügen Sie 1 μL Fast PNGase F hinzu.
- 10 Minuten bei 50 °C inkubieren.
Abbildung 3. Zweistufiger enzymatischer Spaltungseffekt auf Proteinsubstrat (A) und Antikörper (B).
1: Proteinmarker (Kat.-Nr. 20350ES) 2: Konkurrent + Substrat oder Antikörper 3: Konkurrent + Substrat oder Antikörper 4:
Abschluss:
-
Yeasen Fast PNGase F hat unter denselben Reaktionsbedingungen die gleiche oder eine höhere enzymatische Spaltungseffizienz wie importierte Konkurrenzprodukte; - Es wird empfohlen, eine zweistufige enzymatische Spaltung durchzuführen, um eine höhere enzymatische Spaltungseffizienz zu gewährleisten. Einige Antikörper (wie Fab N-Glykosylierung) erfordern einen Vorwärmschritt
für eine effiziente Deglykosylierung.
Darüber hinaus bietet auch reguläre PNGase F (Kat.-Nr. 20407ES, spezifische Aktivität: 100.000 U/ml) und andere Arten von Glykosidasen, wie etwa Endo H-Glykosidase H (Kat.-Nr. 20414ES) und Endo S-Glykosidase S (Kat.-Nr. 20413ES).
Kaufberatung
| Produktnummer | 20406ES | 20407ES | 20414ES | 20413ES |
| Produktname | Schnell PNGase F | PNGase F | Endo H | Endo S |
| Quelle | Rekombinante Hefe-Expression | Rekombinante Hefe-Expression | Rekombinante Hefe-Expression | E.coli rekombinante Expression |
| Spezifische Aktivität | Nicht zutreffend. | 100000U/ml | 1000000U/ml | 8000 U/mg |
| Spaltstelle | Fast alle N-gebundenen Glykane | Fast alle N-gebundenen Glykane | N-gebundene Mannose-reiche Glykane | Spaltt innerhalb der Disaccharid-Kernstruktur der schweren IgG-Kette |
| Verdauungszeit | 10 Minuten | 1-3 Std | 1-3 Std | 1 h |
| Glykosylierung | Geeignet | Geeignet | Geeignet | Geeignet |
| Proteinstruktur | Geeignet | Geeignet | Geeignet | Geeignet |
Bestellinformationen
| Produktname | Produktnummer | Spezifikation |
| 20406ES20/50 | 20 T/50 T | |
| 20407ES01/02 | 15000 U /75000 U | |
| 20414ES92/97 | 10000 U /50000 U | |
| 20413ES80/90 | 1000 HE/5 x 1000 HE |