Aerosolkontamination im Betriebsumfeld als häufigste Ursache für falsch positive Ergebnisse bei PCR-Ergebnissen: Die bahnbrechende Entdeckung der Uracil-DNA-Glykosylase (UDG) durch den amerikanischen Wissenschaftler Lindahl in E. coli und Bacillus subtilis und die Etablierung eines PCR-Kontaminationspräventionssystems durch die Verwendung des UDG-Enzyms mit dUTP.
Die im Handel erhältlichen UDG-Enzyme bestehen hauptsächlich aus zwei Typen: den regulären UDG-Enzymen, die aus Escherichia coli und Bacillus subtilis gewonnen werden, und den thermolabilen UDG-Enzymen, die aus psychrophilen Meeresbakterien gewonnen werden. Die regulären UDG-Enzyme weisen eine höhere Hitzebeständigkeit auf und behalten selbst nach einer Behandlung bei 95 °C für 10 Minuten eine geringe Menge an Uracil-DNA-Glycosylase-Aktivität, was zum Abbau von Zielamplifikationsprodukten führen kann, die dU enthalten. Darüber hinaus bleibt aufgrund der Verwendung gentechnisch veränderter Bakterienstämme (wie E. coli) für die rekombinante Expression molekularer Enzyme eine gewisse Menge an Rest-DNA des Wirtsgenoms in diesen Enzymen zurück. In Verbindung mit den Einflüssen der Herstellungsumgebung und menschlicher Quellen sind molekulare Enzymprodukte sehr anfällig für DNA-Kontamination. Beim Nachweis von Krankheitserregern kann kontaminierende DNA entweder Zielnukleinsäuren mit geringer Häufigkeit maskieren oder zusammen mit ihnen nachgewiesen werden, was die Interpretation der Ergebnisse beeinträchtigt.
Yeasen UCF.ME Uracil-DNA-Glycosylase (UDG/UNG), hitzelabil
Beschreibung
Die UCF.ME Uracil-DNA-Glykosylase (UDG/UNG), hitzelabil, 1 U/μL (Kat.-Nr. 14466ES) Es wird aus psychrophilen Meeresbakterien gewonnen und ist ein hitzelabiles UDG-Enzym mit ultraniedrigen Resten, das als UCF.ME bekannt ist. Die Verwendung dieses Produkts kann verhindern, dass die Restaktivität herkömmlicher UDG-Enzyme nach der Inaktivierung dU-haltige Amplifikationsprodukte bei Raumtemperatur abbaut. Es verhindert auch, dass in molekularen Enzymen vorhandene Hintergrundbakterien zu falsch positiven PCR-Ergebnissen führen. Daher ist die Einführung des thermolabilen UDG-Enzyms mit ultraniedrigen Resten UCF.ME® von entscheidender Bedeutung für die genaue Identifizierung infektiöser Krankheitserreger und die Unterstützung der klinischen Diagnose von Infektionen und Infektionskrankheiten.
Produktvorteile
- Extrem niedriger Restwert von UCF.ME – genomischer DNA-Rest von E. coli <0,1 Kopien/U;
- Geringe Nukleaserückstände – Keine Exonuklease-, Nicking-Enzym- oder RNase-Rückstände;
- Starke Verdauungsfähigkeit – 0,05 U/T können 105 Kopien/T dU-DNA-Produkte verdauen;
- Gute Thermolabilität – vollständige Inaktivierung unter allen Bedingungen von 50 °C für 10 Minuten, 55 °C für 5 Minuten oder 95 °C für 5 Minuten;
- Kompatibel mit RT-qPCR-Reaktionssystemen – Keine Auswirkungen auf das Erkennungssystem, selbst bei hohen Eingangspegeln (2U/20 μL Reaktionssystem).
(1) Proteinreinheit ≥ 95 %
Figur 1. Ergebnisse der Proteinreinheitsbestimmung (SDS-PAGE)
（2）Geringe Restnukleasen: Keine Rest-Exonukleasen, Nicking-Enzyme oder RNasen
Figur 2. Testergebnisse für Nukleaserückstände
（3）E. coli-Genom-DNA-Rückstände < 0,1 Kopien/U, die Rückstandsmengen waren deutlich niedriger als beim herkömmlichen Reagenz
Figur 3. Testergebnisse für genomische DNA-Rückstände von E.coli
Figur 4. Insgesamt 0,05 U des UDG-Enzyms könnten 10^5 Kopien/T dU-DNA-Produkte vollständig verdauen.
Abbildung 5. Nach einer Hitzeinaktivierungsbehandlung bei 50 °C, 10 Min., 55 °C, 5 Min., 55 °C, 10 Min., 95 °C, 5 Min. verlor 14466ES seine Verdauungsfähigkeit.
Abbildung 6. Der RT-qPCR-Mix wurde unter Verwendung von zwei Priming-Sonden der ORF1ab- und N-Gene und 14466ES hergestellt. Als 14466ES in einer Menge von 2U/20μL in das Reaktionssystem injiziert wurde, kam es zu keiner Hemmung der RT-qPCR Reaktion.
Produktempfehlung – Serie von PCR-Enzymrohstoffen mit extrem geringen Rückständen
| Produktpositionierung | Produktname | Katze |
| Kontaminationsverhinderndes hitzelabiles UDG | UCF.ME Uracil-DNA-Glykosylase (UDG/UNG), hitzelabil, 1 U/μL | 14466ES |
| Heißstart-Taq-DNA-Polymerase | Hieff UCF.ME Hotstart Sensitive Taq DNA-Polymerase (5 U/μL) | 14314ES |
| Reverse Transkriptase | Hifair UCF.ME V Reverse Transkriptase (200 U/μL) | 14608ES |
| Muriner RNase-Inhibitor | 14672ES |