Mit der rasanten Entwicklung der Biotechnologie hat die mRNA-Therapie als neue Behandlungsmethode aufgrund ihrer starken Programmierbarkeit und schnellen Reaktionsgeschwindigkeit viel Aufmerksamkeit auf sich gezogen. In den Bereichen mRNA-Impfstoffe und Gentherapie ist die effiziente Synthese hochwertiger mRNA ein entscheidender Schritt zum Erreichen therapeutischer Ziele. Während dieses Prozesses spielt die T7-RNA-Polymerase (T7-RNAP) eine wesentliche Rolle, da sie die In-vitro-Synthese von mRNA effizient katalysieren kann.
Obwohl T7 RNAP eine entscheidende Rolle bei der mRNA-Synthese spielt, entsteht in der Praxis häufig doppelsträngige RNA (dsRNA) als Nebenprodukt. dsRNA ist eines der Kennzeichen vieler Viren und wird daher leicht von intrazellulären dsRNA-bindenden Proteinen erkannt, die angeborene Immunantworten und Entzündungsreaktionen auslösen. Das bedeutet, dass mRNA-Formulierungen, die einen höheren dsRNA-Gehalt enthalten, zu einer unnötigen Immunaktivierung führen können, die die therapeutische Wirksamkeit beeinträchtigen oder schwerwiegende Nebenwirkungen verursachen kann. Überschüssige dsRNA kann auch die normale Funktion von mRNA beeinträchtigen, einschließlich der Translationseffizienz und mRNA-Stabilität, und so indirekt die Wirksamkeit der mRNA-Therapie beeinträchtigen.
Abbildung 1: Der Einfluss von dsRNA-Nebenprodukten und die optimierte T7-RNAP-Reaktion.
Daher ist die Entwicklung und Einführung wirksamer Methoden zur Reduzierung der dsRNA-Erzeugung ein entscheidender Teil der Entwicklung der mRNA-Technologie. Forscher haben verschiedene Strategien entwickelt, darunter die Verwendung verbesserter T7-RNA-Polymerasen, Modifikationsnukleotide, die Optimierung von IVT-Transkriptionspuffern und nachgelagerte Reinigungsverfahren.
Produktdaten
Ausbeute: über 9 mg/mL
dsRNA-Gehalt: Der dsRNA-Gehalt wurde um mindestens das Zehnfache reduziert
Capping-Effizienz: über 99 %
Niedrige dsRNA T7 RNA-Polymerase Screening-Prozess:
1) die Konstruktion einer Zufallsbibliothek und FADS-Hochdurchsatz-Screening-Methode, eine Zufallsmutationsbibliothek von über 10^6 wurde gezeigt.
2) semirationales Design und Mikroplattentechnologie wurden verwendet, um eine stellengesättigte Bibliothek zu screenen. Beide Methoden ergaben T7-RNA-Polymerasemutanten mit niedrigem dsRNA-Gehalt. Unter Berücksichtigung des dsRNA-Gehalts und unter Gewährleistung, dass andere Indikatoren nicht reduziert werden (wie Integrität/Capping-Effizienz/Ausbeute usw.), Es wurden mehrere Mutanten ausgewählt und einer mit der Bezeichnung CleaScrip™ T7 für die kommerzielle Anwendung verwendet.
Produktdaten
In Anwendungsszenarien mit unterschiedlicher Länge hat die T7-RNA-Polymerase mit niedriger dsRNA-Menge im Vergleich zu WT T7 und Konkurrenzprodukten eine höchst signifikante Abnahme gezeigt, während gleichzeitig sichergestellt wird, dass Ausbeute und Integrität nicht verringert werden.
| Fragmentlänge | T7 RNA pol | Ertrag(mg/ml） |
Integrität(%） | dsRNA-Gehalt (produzierte ng dsRNA pro 1 µg RNA) |
| 4K | T7-WT | 12.4 | 88,3 | 0,4273 |
| CleaScrip™ T7 | 12.1 | 89,9 | 0,0129 | |
| Firma A | 11.0 | 87,8 | 0,0323 | |
| 9K | T7-WT | 9,5 | 81,9 | 2,9180 |
| CleaScrip™ T7 | 9,0 | 82,0 | 0,0379 | |
| Firma A | 7.2 | 78,7 | 0,1805 |
Verwenden von Bei einer Cap-Konzentration von 2,5 mM kann im Vergleich zu WT immer noch eine hervorragende Capping-Effizienz über verschiedene Fragmentlängen hinweg erreicht werden. Darüber hinaus wird auch auf zellulärer Ebene eine überlegene Proteinexpressionsleistung beobachtet.
| Cap-Analogeingang (mm） | Begrenzungseffizienz (%）4K | |
| WT | Niedrige dsRNA | |
| 10 | 100 | 100 |
| 5 | 100 | 100 |
| 2.5 | 100 | 100 |
Das Patent wurde in den USA angemeldet.
Produktinformationen
| Produktname | Katalognummer | Spezifikation | Volumen |
| CleascripTM T7-RNA-Polymerase (niedrige dsRNA, 250 U/μL) | 10628ES | 100 /2500 /25.000KU | 400 μL/10 ml/100 ml |
| CleascripTM T7 RNA-Polymerase GMP-Qualität (niedrige dsRNA, 250 U/μL) | 10629ES | 100 /2500 /25.000KU | 400 μL/10 ml/100 ml |