Abbildung 1: In vitro RNA-Transkriptionsprozess

Produktvorteile

Hohe Ausbeute: kann durch Transkriptionsreaktion in 2 Stunden bis zu 200 μg produzieren

Bessere Vielseitigkeit: geeignet für die Transkription von 20nt-10000nt RNA

Hervorragende Leistung: die Nebenprodukte der Transkription während des IVT-Prozesses effektiv zu reduzieren

Vielfältige Einsatzmöglichkeiten: kann für die normale, markierte und modifizierte RNA-Synthese verwendet werden

Produkteigenschaften

Abbildung 2: Ausbeute von Transkripten unterschiedlicher Länge

Abbildung 3: Qualität von Transkripten unterschiedlicher Länge

Abbildung 4: Ausdruck von transkribiert mRNA In HEK-293 Zellen

Hinweis: Die mRNA wurde mit dem Vaccinia Capping Enzyme (Yeasen Nr. 10614/10615) gecappt.

Experimentelle Methoden

Auftaureagenzien

Zentrifugieren Sie den T7 RNA Polymerase Mix kurz und platzieren Sie Es auf Eis. Auftauen 10×Transkriptionspuffer und RibonukleotidS (ATP, CTP, GTP, UTP), mischen und auf den Boden des Röhrchens zentrifugieren, 10 × Transkriptionspuffer bei Raumtemperatur hinzufügen und 4 Arten von Ribonukleotiden auf Eis legen.

B.Assembly-Transkriptionsreaktion bei Raumtemperatur

Bereiten Sie das Reaktionssystem nach dem folgenden System vor:

Komponenten	Volumen (µL)	Endkonzentration
RNase-freies H2O	Bis zu 20	-
10×Transkriptionspuffer	2	1×
CTP / GTP / ATP / UTP (je 100 mM)	je 2	Jeweils 10 mM
Vorlagen-DNA	1 µg	-
T7 RNA-Polymerase-Mischung	2	-

Hinweise:

1. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur durchgeführt. Da der 10× Transkriptionspuffer Spermidin enthält, kann die hohe Konzentration an Spermidin bei niedrigen Temperaturen zu einer DNA-Vorlagenfällung führen.
   Für kurze Transkripte (<100 nt) können 2 µg Vorlage verwendet werden, die Transkriptionszeit verlängert sich auf 4–8 Stunden.
   3. Für lange Transkripte (> 1000 nt) wird empfohlen, linearisierte Plasmide als Vorlagen für die Transkription zu verwenden.
   4. Führen Sie die Reaktion im PCR-Gerät mit geöffnetem Heißdeckel durch, um Verdunstung zu verhindern.
   5. Das Reaktionsprodukt kann einen weißen Niederschlag aufweisen. Der Niederschlag ist das Magnesiumpyrophosphat, das durch die freien Pyrophosphat- und Magnesiumionen in der Reaktionslösung, die die nachfolgenden Experimente nicht beeinträchtigen. Wenn Sie sie entfernen möchten, können Sie etwas EDTA hinzufügen. Wenn die Zugabe von EDTA nachfolgende Experimente beeinträchtigt, kann der Überstand auch durch Zentrifugieren zurückgewonnen werden.
   6. Bewahren Sie die Reagenzien und Behälter frei von RNase-Kontamination auf.

C. 2 Stunden bei 37 °C inkubieren.

Mischen Sie die Komponentenlösung, zentrifugieren Sie sie kurz auf den Boden des Röhrchens und inkubieren Sie sie 2 Stunden lang bei 37 °C. Wenn die Transkriptlänge weniger als 100 nt beträgt, verlängern Sie die Reaktionszeit auf 4–8 Stunden.

D.DNase I-Behandlung (optional)

Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, geben Sie 2 μl DNase I (RNase-frei) in jedes Röhrchen und inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei 37 °C, um die Matrizen-DNA zu entfernen.

Häufig gestellte Fragen

1. Geringe Transkriptausbeute

Die Qualität der Vorlage hängt eng mit der Ausbeute zusammen. Die Ausbeute der Versuchsgruppe ist deutlich geringer als die der Kontrollgruppe. Mögliche Gründe sind:

• Die Versuchsvorlage enthält hemmende Komponenten;
• Möglicherweise ist mit der Vorlage etwas nicht in Ordnung.

Vorschläge: ① Reinigen Sie die Vorlage erneut; ② Bestimmen Sie die Vorlagenquantifizierung und ihre Integrität; ③ Verlängern Sie die Reaktionszeit; ④ Erhöhen Sie die Menge der Vorlageneingabe; ⑤ Verwenden Sie andere Promotoren und andere RNA-Polymerasen.

2. Geringe Ausbeute an Kurztranskripten

Kurze Matrizenfragmente können die Reaktion hemmen. Wenn das Transkriptionsprodukt weniger als 100 nt beträgt, verlängern Sie die Reaktionszeit auf 4-8 Stunden oder erhöhen Sie die Matrizenmenge auf 2 μg, wenn Sie die Ausbeute erhöhen möchten.

3. Die RNA-Transkriptionslänge beträgt größer als erwartet

Wenn das Ergebnis der Elektrophorese zeigt, dass das Produktband größer als erwartet ist, kann dies folgende Gründe haben: ①Die Plasmidvorlage ist möglicherweise nicht vollständig linearisiert; ②Das 3'-Ende des Sinnstrangs weist eine markante Struktur auf; ③Die RNA weist eine Sekundärstruktur auf, die nicht vollständig denaturiert ist.

Vorschläge: ①Überprüfen Sie, ob die Vorlage vollständig linearisiert ist, und führen Sie bei Bedarf eine zusätzliche Linearisierung durch. ②Wählen Sie ein geeignetes Restriktionsenzym, um 3'-Überhänge zu vermeiden, oder verwenden Sie Klenow-Fragment/T4-DNA-Polymerase, um die Transkription abzuschließen, bevor Sie fortfahren. ③Verwenden Sie denaturiertes Gel, um RNA-Produkte zu erkennen.

4. Die RNA-Transkriptionslänge beträgt kleiner als erwartet

Wenn die Elektrophorese zeigt, dass das Produktband kleiner als die erwartete Größe ist, sind die möglichen Gründe sind: ①Die Vorlage enthält eine Terminationssequenz ähnlich dem T7-RNA-Polymerase-Terminator; ②Der GC-Gehalt von die Schablone ist zu hoch.

Vorschläge: ①Reduzieren Sie die Reaktionstemperatur (z. B. 30 °C). Manchmal kann eine Senkung der Temperatur dazu beitragen, die Transkriptionslänge zu verlängern, aber es kann reduzieren Sie den Ertrag. Versuchen Sie andere RNA-Polymerasen für die Transkription; ②Wenn der GC-Gehalt der Vorlage hoch ist, führen Sie die Reaktion bei 42 °C durch oder fügen Sie SSB hinzu, um die Ausbeute und die Transkriptionslänge zu erhöhen.

5. Elektrophoretisches Tailing von Transkriptionsprodukten

Tailing während der Elektrophorese kann folgende Ursachen haben: ① RNase-Kontamination während des Versuchsbetriebs; ②Die DNA-Vorlage ist mit RNasen kontaminiert.

Vorschläge: ①Verwenden Sie RNase-freie Pipettenspitzen und EP-Röhrchen, tragen Sie Einweghandschuhe und Masken aus Latex und bereiten Sie alle Reagenzien mit RNase-freiem H vor.₂O. ②Reinigen Sie die Vorlagen-DNA erneut.

Bestellinformationen

Produktname	Katalognummer	SSpezifikation
T7 RNA-Synthese-Kit mit hoher Ausbeute	10623ES	50/100/500 T
T7 RNA-Polymerase, GMP-Qualität (250 U/μL)	10625ES	10KU/100KU/2500KU/25MU
Pyrophosphatase, anorganische GMP-Qualität (1 U/μL)	10620ES	10U/100U/1000U
Muriner RNase-Inhibitor, GMP-Qualität (40 U/μL)	10621ES	10KU/20KU/100KU/1MU
mRNA Vaccinia Capping Enzyme GMP-Qualität	10614ES	2 KU/10 KU/100 KU
mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase GMP-Qualität	10612ES	10 KU/50 KU/250 KU
Desoxyribonuklease I (DNase I) GMP-Qualität	10611ES	500/2000/10000 U
Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit	12603ES	24/96 T