Dieser Artikel beschreibt die Anwendung von Concanavalin A und seine kovalente Kopplung mit magnetischen Perlen.
Teil 1. Concanavalin A
Concanavalin A-beschichtete Magnetkügelchen (ConA-Kügelchen) sind, wie der Name schon sagt, biomagnetische Kügelchen, in denen das Pflanzenlektin Concanavalin A (ConA) mit superparamagnetischen Nanomaterialien gekoppelt ist. Im Folgenden finden Sie eine kurze Einführung in ConA-Magnetkügelchen.
Concanavalin A (ConA), ein pflanzliches Lektinprotein ohne Blutgruppenspezifität, war das erste pflanzliche Lektinprotein seit 1936, das aus der Cuttlebohne (Canavalia ensiformis, Pennisetum maritimum) isoliert, gereinigt und kristallisiert wurde.
ConA hat je nach pH-Wert der Lösung, in der es vorhanden ist, zwei Hauptformen: das α-2-Homodimer oder das α-4-Homotetramer [2]. Unter alkalischen Bedingungen (pH>7,0) liegt es als Tetramer vor (bestehend aus vier Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von 26 kDa); unter sauren Bedingungen (pH 4,5-5,5) dissoziiert Con A in eine aktivierte dimere Struktur (52 kDa). Darüber hinaus wird die Funktion von ConA durch zweiwertige Kationen beeinflusst, z. B. in Abwesenheit von Metallionen (Ca2+ und Mn2+), seine Konformation und Glykoproteinbindungsfunktion können nicht realisiert werden[1].
Abb. (1). Molekulare Modellierung von (A) ConA-Monomer, (B) ConA-Dimer, (C) ConA-Tetramer mit Mannose, Glucose und Metallionen.
Teil 2. Perlen
Biomagnetische Perlen sind eine Klasse magnetischer Mikrokugeln mit Nanometer-Partikelgröße, die aus Polymeren und anorganischen magnetischen Nanopartikeln bestehen. Magnetische Perlen können je nach ihrer Struktur in drei Hauptkategorien eingeteilt werden: Kern-Schale-Struktur, Sandwich-Struktur und diffuse Struktur. Zu den magnetischen Materialien gehören reines Eisenpulver, Carbonyleisen, magnetisches Erz, Orthoferrit und Eisen-Kobalt-Legierung. et al.
Magnetische Nanomaterialien, aufgrund ihrer besonderen Effekte, wie Kleingrößeneffekt, Oberflächeneffekt und Quantengrößeneffekt usw., in der Größe von Fe3O4 Nanopartikel sind kleiner als 30 nm, die Interferenz der thermischen Störung innerhalb der Nanopartikel ist erheblich, und zu diesem Zeitpunkt zeigen diese Nanopartikel eine besondere magnetische Eigenschaft, nämlich Superparamagnetismus. Superparamagnetisches Fe3O4 Aufgrund ihrer hochwertigen Eigenschaften wie Ungiftigkeit, gute Biokompatibilität, einzigartige magnetische Zieleigenschaften und einfache Wärmeentwicklung in wechselnden Magnetfeldern werden Nanopartikel in der Bioindustrie häufig eingesetzt.
Im Gegensatz dazu bietet die kovalente Kopplung von ConA mit Mikrokügelchen zur Immobilisierung von Biomolekülen folgende Vorteile:
- Hohe Stabilität der kovalenten Kopplungsbindung für Reproduzierbarkeit;
- Ligand-ConA-Bindung auf der Oberfläche von Mikrokügelchen für Zielmolekül-Interaktionen;
- Kinetische Charakterisierung der Lösungsumgebung, geeignet für die biologische experimentelle Manipulation;
Teil 3. Anwendung von ConA Magnetperlen
Wie in der Literatur berichtet, werden die Hauptanwendungen der ConA-Magnetkügelchen in drei Szenarien eingeteilt: die Durchführung einer Trennung zytoplasmatischer Membranen, die Anreicherung von Glykoproteinen und die Trennung immobilisierter zellulärer Aspekte.
Anwendung I: Trennung der Zytoplasmamembran
Verwendung von ConA-Magnetkügelchen, die durch die Aktivierung zweiwertiger Kationen beeinflusst werden, so dass sie in Ca vorliegen2+ und Mg2+ Lösungsumgebungen, die die Funktion der Affinitätsinteraktion von terminalem α-D-Mannosyl und α-D-Glucosyl besitzen, die bei der Plasmamembranreinigung verwendet werden, sind eine einfache und effiziente Methode. Beispielsweise ist die Plasmamembrantrennung von Zellen oder Geweben ein wichtiger Schritt, um weitere Plasmamembranproteine zu erhalten. ConA kann glykosylierte Proteine auf Zellen binden, und dieses Prinzip kann genutzt werden, um Plasmamembranen mit höherer Reinheit zu erhalten. Die wichtigsten Arbeitsschritte sind: Immobilisierung von ConA auf magnetischen Kügelchen durch Bindung von biotinyliertem ConA an magnetische Streptavidinkügelchen; Inkubation von Zellmembranen mit ConA-Magnetkügelchen für 1 Stunde; Adsorption auf einem magnetischen Gestell; 5-maliges Waschen mit TBS; und Elution der zytoplasmatischen Membranlösung mit Eluent[3].
Abb. 2. ConA-Magnetkügelchen-Reinigungsschritte für Plasmamembranen
Anwendung II: Glykoproteinanreicherung
ConA ist spezifisch für Mannose und Glucose und erkennt α-konjugierte Mannose, die zufällig das „Kernoligosaccharid“ vieler Serum- und Zellmembran-Glykoproteine ist. Daher kann es in der Immunologie verwendet werden, um glykosylierte Moleküle wie Glykoproteine in Zell- oder Gewebelysaten oder Serum zu trennen.
Ein wichtiger Eingriff war die durch Vernetzung von aminosilanisierten magnetischen Nanoperlen (MNPs) mit ConA über einen bifunktionellen Linker, Bis-N-Hydroxysuccinimid-Linoleat (DSS), um ConA-Magnetkügelchen zu erhalten; Beendigung der unspezifischen Bindung der magnetischen Nanoperlen mithilfe von Methoxyethylenglykol (MEG) und Durchführung der magnetischen Trennung; Zugabe des Extrakts der mit Trypsin verdauten Zellmembranproteine, um sowohl die ConA-Magnetkügelchen als auch die eingefangenen Glykopeptide zu inkubieren und schließlich die eingefangenen Glykopeptide zu eluieren und eine Vakuumtrocknung durchzuführen. ConA-Magnetkügelchen wurden beide inkubiert, die ConA-Magnetkügelchen, die Glykoproteine gebunden hatten, wurden vom Magnetgestell gesammelt, die Nicht-Glykopeptide wurden gewaschen und schließlich wurden die eingefangenen Glykopeptide eluiert und vakuumgetrocknet. Diese Methode ermöglicht eine eingehende Analyse spezifischer Glykosylierungsstellen von tumorassoziierten Proteinen (z. B. EGFR).[4].
Abb. 3. Superparamagnetische Nanopartikel gekoppelt an verschiedene Lektine
Anwendung III: Isolierung immobilisierter Zellen
Die Verwendung von ConA-Magnetkügelchen (Magnetkügelchen, die kovalent an das hochreine Begleitmaterial Concanavalin A gebunden sind) zur Bindung an Glykoproteine auf Zellmembranen oder Kernmembranen und damit zur Erfassung von Zellen oder Kernen ermöglicht die Visualisierung der experimentellen Manipulation kleiner Zellzahlen. Beispielsweise werden ConA-Magnetkügelchen in CUT&Tag und CUT&RUN verwendet. [5] Experimente, bei denen es sich um neuartige Techniken zur Untersuchung der Struktur und Funktion von Chromatin handelt. Sie werden durch die Bindung magnetischer ConA-Kügelchen an die Zellen immobilisiert, um den Vorgang zu visualisieren und das Problem des Zellverlusts durch Zentrifugation zu vermeiden.
Im Vergleich zur herkömmlichen ChIP-seq-Technologie zum Studium von DNA-Protein-Interaktionen bieten CUT&Tag und CUT&RUN folgende Vorteile:
- Magnetische ConA-Kügelchen binden an Zellmembran-Glykoproteine, um die Operation zu visualisieren und das experimentelle Operationserlebnis zu verbessern.
- Keine Zentrifugation erforderlich, nur ConA-Magnetkügelchen, die auf dem Magnetgestell adsorbiert sind, um die Trennung von Zellproben und Lösungen abzuschließen;
- Kann mit nur 10 Zellen betrieben werden, wodurch die Notwendigkeit einer großen Anzahl von Proben für ChIP-seq umgangen wird.
Abb. 4. Schematische Darstellung des Experimentablaufs von ChIP-seq, CUT&Tag und CUT RUN
Teil 4. YEASEN Concanavalin A-beschichtete Magnetkügelchen
Die von YEASEN entwickelten ConA-Magnetkügelchen können nach strenger Rohstoffauswahl und mehrfacher Prozessoptimierung und -verbesserung schnell, effizient, empfindlich und spezifisch an Glykoproteine, Glykolipide, Polysaccharide und andere Moleküle mit Glykosylierungsmodifikation binden. Sie werden hauptsächlich zur Zellisolierung oder zur Isolierung glykosylierter Moleküle wie Glykoproteine in Zell- oder Gewebelysaten oder Serum verwendet und insbesondere direkt für Experimente wie CUT & RUN und CUT & Tag (eine innovative Technologie für ChIP-seq-Experimente) eingesetzt.
1.Produkteigenschaften
- Stabile Chargenproduktion und bessere Reproduzierbarkeit der Ergebnisse;
- Stabiler Performance-Speicher
- Zellerfassungseffizienz > 90 %
2.Produktinformationen
| Katzen-Nr. | Kat.-Nr.: 19810ES |
| Größe | 1 ml/5 ml/20 ml |
| Farbe | Bräunlich gelb |
| Perlenkonzentration | 10 mg/ml |
| Feststoffgehalt | 9-11 mg/ml |
| Perlengröße | 1 µm |
| Kapazität | 105 Zellen/µL Perlen |
3.Produktleistungsdaten
(1)Monodispersität
Unter den gleichen Behandlungsbedingungen und bei einer Vergrößerung von 10×/40× waren die ConA-Perlen grundsätzlich monodispers, und es wurde im Vergleich zum Konkurrenten keine offensichtliche Agglomeration beobachtet.
| YEASEN Rohmaterialperlen | Konkurrent ConA Perlen | YEASEN ConA-Perlen (Kat.-Nr. 19810) |
Abb. 5. Diagramm der Monodispersitätsergebnisse
(2)Wirkung der ConA-Kügelchen-Bindung an Zellen
Die gleiche Anzahl von Zellen wurde mit den Perlen für die gleiche Zeit inkubiert, und die Anzahl der nach der Konjugation der ConA-Perlen verbleibenden Zellen wurde automatisch unter dem Zellanalysator erkannt, und die Ergebnisse zeigten, dass die YEASEN ConA-Perlen (Kat.-Nr. 19810) übertrafen die Produkte der Konkurrenz.
| Zellsuspension | Verbleibende Zellen nach Bindung kompetitiver ConA-Magnetkügelchen | Nach der Bindung von YEASEN verbleibende Zellen ConA Magnetperlen |
Abb. 6.Bild von an magnetische Kügelchen gebundenen ConA-Zellen
(3) Zellbindungszahl und Wiederholbarkeit
Sowohl die 10µL YEASEN ConA Beads (Kat.-Nr. 19810) und die 10 µl ConA Beads des Mitbewerbers binden Zellen auf E7-Niveau in einer mit dem Mitbewerber vergleichbaren Anzahl. Die Zellaufnahme betrug bei wiederholten Vorgängen >90 %.
Abb. 7. Die Ergebnisse Anzahl der ConA-Kügelchen bindenden Zellen und Erfassungsrate
(4)Beschleunigungsstabilität
Abgabe bei 1 ml/Röhrchen. Die Lagerbedingungen waren: 4 °C, 37 °C beschleunigte Behandlung für 2, 4, 7, 11 und 14 Tage und -20 °C Zerstörungsbehandlung für 1, 3, 6 und 8 Tage. Die Ergebnisse zeigten, dass unter denselben Versuchsbedingungen: die Zellerfassungsrate der bei 4 °C gelagerten Produkte, der beschleunigten Behandlung bei 37 °C und der Zerstörungsbehandlung bei -20 °C >95 % betrug und der CV-Wert der drei Replikationsgruppen unter jeder Behandlungsbedingung innerhalb von 1 % lag, was eine gute Reproduzierbarkeit zeigte.
Abb. 8. Die Ergebnisse der Zellerfassungsrate und Wiederholbarkeitsverzerrung von ConA-Perlen bei unterschiedlichen Temperaturen und Zeiten
Bestellinformationen
| 19810ES |