Yeasen und Molefuture entwickelten thermotolerante T4 -DNA -Ligase mit hoher Wiedergabetreue zur Bekämpfung falscher Ligation

Yeasen und Molefuture führen fortschrittliche T4-DNA-Ligase ein, um molekularbiologische Herausforderungen zu bewältigen

Yeasen und Molefuture haben gemeinsam mithilfe ihrer ZymeEditor-Plattform eine hochmoderne T4-DNA-Ligase entwickelt, die sich mit Schlüsselfragen der Molekularbiologie und der DNA-Bibliothekskonstruktion für die Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) befasst. Herkömmliche T4-DNA-Ligase ist mit Herausforderungen wie mangelnder Stabilität, hoher Adapter-Dimer-Bildung und hoher DNA-Fragment-Selbstligation konfrontiert. Dieses neuartige Enzym soll diese Einschränkungen überwinden.

T4-DNA-Ligase, ein ATP-abhängiges Enzym, verfügt über eine kompakt-helikale DNA-Bindungsdomäne (DBD), eine Nukleotidyl-Transferase-Domäne (NTase) und eine OB-Faltungsdomäne. Durch Analyse der Proteinstruktur identifizierten die Forscher Schlüsselreste innerhalb von 5 bis 20 Å des DNA-Substrats. Mithilfe fortschrittlicher Computertools, In-silico-Screening und Struktur-Funktions-Analyse entwickelten sie Mutanten durch Konsenssequenz-Alignment und integrierten strukturell-funktionelle Erkenntnisse.

Zusätzlich zum rationalen Design verwendete das Team die MTPS-Methode für die gerichtete Evolution und untersuchte über 10.000 Mutanten auf Stabilität, Aktivität und Restaktivität. Vielversprechende Kandidaten wurden einer gründlichen Reinigung und Prüfung unterzogen. Es folgte eine detaillierte Charakterisierung, bei der Aktivität, Stabilität, Adapter-Selbstligation, DNA-Fragment-Selbstligation und DNA-Ausbeute bewertet wurden.

Die Forscher kombinierten rationales DNA-Design und gezielte Mutation an G1-Mutanten, um außergewöhnliche Varianten zu entwickeln, die für verschiedene Anwendungen geeignet sind. Dieser umfassende Ansatz führte zu einer hocheffizienten und zuverlässigen T4-DNA-Ligase, die die molekularbiologische Forschung und den Aufbau von DNA-Bibliotheken in NGS verbessern soll.

Abbildung 1. Veranschaulicht die Entwicklung der Versatility T4 DNA Ligase. (A) Rationales Design von T4-DNA-Ligase. (B) Screening thermotoleranter T4-DNA-Ligase-Mutanten bei 45 °C, was zur Identifizierung von Mutanten mit deutlich erhöhter spezifischer Aktivität führte. (C) Screening von T4-DNA-Ligase-Mutanten mit dem Ziel, die Bildung von Adapter-Dimeren während der DNA-Bibliotheksherstellung zu reduzieren. (D) Die Auswertung der Bibliothekserträge erfolgte nach einer einstündigen Wärmebehandlung bei 42 °C unter Verwendung der Methode zur DNA-Bibliotheksherstellung.
Tabelle 1. Yeasen Versatile T4 DNA-Ligase ist thermostabil. Das Enzym wurde 5 Tage lang bei 30 °C behandelt und mit der DNA Lib Prep-Methode analysiert.
Abbildung 2. Yeasen Versatile T4 DNA Ligase hat eine höhere Genauigkeit im Vergleich zur Wildtyp (WT) T4 DNA Ligase, angezeigt durch geringere Adapterdimerbildung aufgrund von Selbstfehlligation (A) und (B), analysiert mit der DNA Lib Prep-Methode.
Abbildung 3. Yeasen Versatile T4 DNA Ligase zeigt die geringste Adapterdimerbildung im Vergleich zu den kommerziellen T4 DNA Ligasen, einschließlich thermotoleranter Ligasen, die mit der DNA Lib Prep-Methode analysiert wurden.
Dieser Durchbruch unterstreicht das Engagement von Yeasen und Molefuture für Innovation und Spitzenleistung in der Enzymtechnik.

Bestellinformationen

Name Katze# Hinweise
Enzym Hieff™ Vielseitige T4 DNA Ligase (600 U/µL) 12996ES Thermotolerant und hohe Wiedergabetreue für die Tumorgenerkennung
DNA Hieff NGS® DNA-Bibliotheksvorbereitungskit 13577ES Tumor/ Mechanische Methode
Hieff NGS® OnePot Pro DNA-Bibliotheksvorbereitungskit V2 12194ES Tumor/ Enzymatische Methode
Hieff NGS® OnePot II DNA Library Prep Kit für Illumina 13490ES Pathogen/ Enzymetisch/ normale Zeit (140min)
Hieff NGS® OnePot Flash DNA-Bibliotheksvorbereitungskit 12316ES Pathogen/ Enzymatisch/ Ultraschnell (100 Minuten)
Hieff NGS® DNA&RNA Library Co-Prep Kit V2 12305ES Pathogen/ Enzyme/ DNA & RNA Co-Prep
RNA Hieff NGS® Ultima Dual-Mode mRNA-Bibliotheksvorbereitungskit 12308ES Ohne Oligo dT Magnetkügelchen, 11 Röhrchen
Hieff NGS® Ultima Dual-Mode mRNA-Bibliotheksvorbereitungskit 12309ES Oligo dT Magnetperlen plus, 14 Röhrchen
Hieff NGS® Ultima Dual-Mode RNA-Bibliotheksvorbereitungskit 12310ES Vorgemischte Version, 5 Tuben
Hieff NGS ® EvoMax RNA Library Prep Kit (Vorgemischte Version) (Actinomycin D Frei) 12340ES Vorgemischte Version, (Actinomycin D Frei)
Hieff NGS® MaxUp rRNA-Depletion Kit (Pflanze) 12254ES Anlage
Hieff NGS® MaxUp Human rRNA Depletion Kit (rRNA und ITS/ETS) 12257ES Menschlich

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Über Molefuture Biotechnology

Molefuture Biotechnology ist eine Tochtergesellschaft von Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. ist auf die Bereitstellung maßgeschneiderter Enzymmodifizierungslösungen auf Basis der Enzymevolutionstechnologie spezialisiert. Nutzung der Ressourcen von Yeasen Biotechnologie: Molefuture arbeitet auf sechs großen Technologieplattformen: der innovativen Enzymevolutionsplattform ZymeEditor, einer Multi-Host-Hocheffizienz-Expressionsplattform, einer Fermentationsprozess-Entwicklungsplattform, einer Aufreinigungsprozess-Entwicklungsplattform, einer ultrareinen Enzymproduktionsplattform und einer Enzymanalyse- und Qualitätskontrollplattform. Mit diesen sechs Technologieplattformen kann Molefuture ein komplettes Set an maßgeschneiderten Lösungen anbieten, darunter enzymgesteuerte Evolution, Entwicklung neuer Enzyme, Entwicklung von Enzymprozessen und Scale-up-Produktion auf GMP-Niveau, um den Anwendungsanforderungen von Enzymen in Bereichen wie In-vitro-Diagnostik, Biomedizin, synthetische Biologie, medizinische Ästhetik, pharmazeutische Zwischenprodukte usw. gerecht zu werden.

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