مایکوپلاسما، همچنین به عنوان ارگانیسم‌های شبه پلوروپنومونی (PPLO) شناخته می‌شود، کوچک‌ترین و ساده‌ترین پروکاریوت‌هایی هستند که تاکنون کشف شده‌اند و فاقد دیواره سلولی هستند. قطر آنها 0.1 تا 0.3 میکرومتر است، می توانند از فیلترها عبور کنند و پلئومورفیسم بالایی از خود نشان می دهند. آنها نسبتاً رایج هستند و شناسایی آلاینده های باکتریایی در کشت سلولی پستانداران دشوار است

آلودگی مایکوپلاسما اثرات نامطلوب متعددی بر روی کشت سلولی دارد و به یک موضوع جدی در روش‌های کشت سلولی تبدیل شده است. به طور محافظه کارانه تخمین زده می شود که میزان آلودگی مایکوپلاسما در کشت های معمول سلولی از 15٪ تا 35٪ است که به طور جدی با اعتبار نتایج تجربی تداخل دارد.

تقریباً 95 درصد از آلودگی مایکوپلاسما در کشت های سلولی عمدتاً توسط Acholeplasma laidlawii، Mycoplasma arginini، Mycoplasma orale، Mycoplasma fermentans، Mycoplasma hominis و Mycoplasma hyorhinis ایجاد می شود. در محیط های کشت، کلنی های مایکوپلاسما ظاهر "تخم مرغ سرخ شده" را تشکیل می دهند. رویی کشت سلولی و غشای سلولی محیط مناسبی برای رشد مایکوپلاسما فراهم می کند و مایکوپلاسماهایی که سطح سلول ها را انگلی می کنند می توانند به غشای سلول میزبان نفوذ کنند.

منابع اصلی آلودگی مایکوپلاسما عبارتند از: محیط کشت سلولی یا اجزای آن (مانند مواد خام برای محیط، سرم و سایر معرف ها)، پرسنل آزمایشگاه، انکوباتورهای کشت سلولی، مخازن ذخیره نیتروژن مایع، ذرات معلق در هوا و ذرات معلق در هوا، استفاده بیش از حد از آنتی بیوتیک ها، سلول های نادرست مهر و موم شده با کشت سلولی مای تامین،

در همین حال، خطرات مربوط به این آلودگی ها عبارتند از: منجر به از بین رفتن دسته ای محصولات سلولی یا محصولات تولید شده با استفاده از سلول ها به عنوان یک محیط به دلیل عدم توانایی در حذف موثر مایکوپلاسما در طول تصفیه پایین دست. آلوده كردن كليه تجهيزات و تأسيسات مربوطه و نيز محصولات مياني يا نهايي كه با مواد آلوده در تماس هستند. باعث آلوده شدن سایر سلول های طبیعی توسط مایکوپلاسما می شود. منجر به از بین رفتن بانک های مهم سلولی یا بذر ویروسی به دلیل آلودگی مایکوپلاسما می شود. مجبور کردن آزمایشگاه به توقف تولید یا عملیات آزمایشی برای رسیدگی به آلودگی مایکوپلاسما؛ منجر به ایجاد مقاومت مایکوپلاسما می شود و حذف آن را حتی دشوارتر می کند. گسترش منطقه آلودگی مایکوپلاسما؛ و تهدیدی برای سایر کشت های سلولی در آزمایشگاه است.

بنابراین، آزمایش و حذف منظم مایکوپلاسما باید انجام شود تا اطمینان حاصل شود که هیچ مایکوپلاسما در سیستم کشت سلولی وجود ندارد، که برای پیشرفت طبیعی تحقیقات علمی ضروری است.

مایکوپلاسما تشخیص

مایکوپلاسما یک نوع آلودگی نسبتاً شایع اما معمولاً به سختی قابل حذف است. برای فرآیندهای بیولوژیکی که شامل کشت سلولی است، مقررات ایجاب می کنند که "نباید آلودگی مایکوپلاسما وجود داشته باشد."

نسخه 2020 فارماکوپه چینی، جلد III، «تهیه و کنترل کیفیت بسترهای سلولی حیوانی برای تولید و آزمایش محصولات بیولوژیکی» تصریح می‌کند که برای سلول‌هایی که در تولید استفاده می‌شوند، آزمایش مایکوپلاسما باید در بانک سلولی اصلی (MCB)، بانک سلولی کار (WCE-Production) انجام شود.
FDA، راهنمای صنعت: خصوصیات و صلاحیت بسترهای سلولی و سایر مواد بیولوژیکی مورد استفاده در تولید واکسن‌های ویروسی برای نشانه‌های بیماری عفونی، تصریح می‌کند که کنترل مایکوپلاسما باید بر روی مواد خام، دانه‌های ویروس، مایعات برداشت‌نشده فرآوری‌نشده و سایر مواد انجام شود.
ICH Q5D، «اشتقاق و خصوصیات بسترهای سلولی مورد استفاده برای تولید محصولات بیوتکنولوژیکی/بیولوژیکی»، همچنین اشاره می‌کند که کنترل مایکوپلاسما باید بر روی مواد خام، دانه‌های ویروس، مایعات برداشت نشده و سایر مواد از این قبیل انجام شود.

شکل 1 نقاط تست آلودگی مایکوپلاسما که طبق مقررات داخلی و بین المللی مورد نیاز است

روش‌های سنتی تشخیص مایکوپلاسما عمدتاً شامل روش‌های کشت و روش‌های سلول‌های شاخص است. با این حال، به دلیل چرخه های طولانی تشخیص یا مسائل حساسیت این دو روش، منجر به توسعه چرخه تولید یا انتشار محصول برای شرکت ها می شود. با توسعه سلول درمانی و ژن درمانی، الزامات صنعت برای به موقع بودن و حساسیت تشخیص مایکوپلاسما به طور فزاینده‌ای سخت‌تر شده است. ماندگاری کوتاه برای پشتیبانی از چنین دوره های تشخیص طولانی کافی نیست، به همین دلیل است که روش سریع NAT (تست نوکلئیک اسید) در بین روش های مختلف تشخیص مایکوپلاسما برجسته شده است.

شکل 2 روش های تشخیص مایکوپلاسما که در مقررات داخلی و بین المللی ذکر شده است

بر اساس NAT (تکنیک‌های تقویت اسید نوکلئیک)، Yeasen مجموعه‌ای از کیت‌های تشخیص سریع مایکوپلاسما را توسعه داده است، از جمله کیت تشخیص مایکوپلاسما Real-time qPCR، کیت تشخیص مایکوپلاسما یک مرحله‌ای MycAway™ Plus-Color و کیت تست مایکوپلاسما GMyc-PCR.

1.کیت تشخیص واقعی qPCR مایکوپلاسما

این محصول برای تشخیص سریع و کیفی آلودگی بالقوه مایکوپلاسما در مواد خام تولیدی، بانک های سلولی، دانه های ویروسی، مایعات برداشت سلولی یا ویروسی و سلول های درمانی است. این در درجه اول در تحقیق، توسعه، تولید و فرآیندهای انتشار بیوداروها استفاده می شود.

صلاحیت های محصول

رعایت مقررات: تایید شده بر اساس الزامات داروسازی های EP2.6.7، JP G3 و USP 63، مطابق با استانداردهای سازمان های معتبر بین المللی.

انطباق حسابرسی: تولید محصول با استانداردهای سیستم مدیریت کیفیت ISO13485 مطابقت دارد و توسط اسناد ممیزی جامع پشتیبانی می شود.

تضمین کیفیت: تمام مواد خام آنزیمی مورد نیاز برای کیت، خود تولید شده و صنعتی شده اند و تامین پایدار را تضمین می کنند.

انباشت تجربه فنی: یک پایه فنی محکم در روش TaqMan وجود دارد و حساسیت کیت می تواند به 10 CFU/mL و کمتر برسد.

تمرکز بر عملکرد محصول: کتابخانه آنتی بادی آنزیم Taq، با آنتی بادی های مسدود کننده دوگانه، ویژگی، حساسیت و پایداری کیت را افزایش می دهد.

ویژگی های محصول

انواع تشخیص چندگانه: کاوشگرهای TaqMan بهینه شده می توانند تا 183 گونه مایکوپلاسما را شناسایی کنند.

استفاده آسان: کل زمان آماده سازی و آزمایش نمونه کمتر از 3 ساعت است که نیاز به انتظار 28 روزه مرتبط با روش های کشت را از بین می برد.

حساسیت بالا: حد تشخیص کمتر از 10 CFU/mL است که آن را به یک جایگزین مناسب برای روش‌های کشت مستقیم تبدیل می‌کند.

ویژگی بالا: پرایمرها و پروب ها با هدف قرار دادن 16S rRNA طراحی شده اند و از عدم واکنش متقاطع با گونه های نزدیک مانند کلستریدیا و لاکتوباسیل ها اطمینان حاصل می کنند.

ایمنی بالا: کنترل مثبت (PC) در کیت غیر عفونی است و خطر آلودگی را کاملاً از بین می برد.

مقاومت در برابر تداخل قوی: معرفی یک کنترل داخلی (IC) به حذف تداخل و ناهنجاری های نمونه در آماده سازی واکنش کمک می کند و به طور موثر از منفی کاذب جلوگیری می کند.

شکل 3 گردش کار برای تشخیص مایکوپلاسما با استفاده از کیت تشخیص qPCR بلادرنگ مایکوپلاسما

کیت تشخیص مایکوپلاسما یک مرحله ای MycAway™ Plus-Color

از یک فناوری تقویت همدما منحصر به فرد استفاده می کند که تمایز رنگ بالاتری را ارائه می دهد. تغییر از بنفش آبی (منفی) به آبی آسمانی (مثبت) با چشم غیرمسلح به راحتی قابل تشخیص است. علاوه بر این، شامل اجزای ضد آلودگی برای از بین بردن وقوع مثبت کاذب است.

شکل 4: روش عملیات برای تشخیص مایکوپلاسما با استفاده از کیت تشخیص مایکوپلاسما یک مرحله‌ای MycAway™ Plus-Color

3.GMyc-PCR مایکوپلاسما تشخیصکیت

بر خلاف روش‌های مرسوم تشخیص PCR یک مرحله‌ای، تعداد پرایمرها از یک جفت به سه جفت افزایش می‌یابد و مناطق حفاظت‌شده مایکوپلاسما 16S و 23S rRNA را برای تقویت PCR تودرتو مورد هدف قرار می‌دهند. این نه تنها محصولات غیر اختصاصی را کاهش می دهد، بلکه حساسیت محصول را نیز به میزان قابل توجهی افزایش می دهد و امکان تشخیص تعداد کمی از مایکوپلاسما را فراهم می کند.

شکل 5 روش عملیات برای تشخیص مایکوپلاسما با استفاده از کیت تست مایکوپلاسما GMyc-PCR

حذف مایکوپلاسما

در فرآیند کشت سلولی، آزمایش منظم می تواند به طور موثر از آلودگی مایکوپلاسما در مقیاس بزرگ جلوگیری کند. با این حال، اگر سلول‌ها قبلاً به مایکوپلاسما آلوده شده‌اند، باید به سرعت با آنها برخورد کرد. بهترین روش این است که سلول های آلوده را تحت فشار بالا استریل کنید و سپس آنها را دور بریزید تا از آلوده شدن سایر خطوط سلولی تمیز جلوگیری کنید. اگر سلول‌های آلوده ارزش خاصی داشته باشند و نیاز به حذف آلودگی مایکوپلاسما باشد، می‌توان از ترکیب آنتی‌بیوتیک‌ها برای رسیدن به این هدف استفاده کرد. از آنجایی که مایکوپلاسماها فاقد دیواره سلولی هستند، آنتی بیوتیک های سنتی به طور کلی در برابر آنها بی اثر هستند. بنابراین، انتخاب یک معرف حذف مایکوپلاسما مناسب بسیار مهم است.

Yeasen's MycAway™ Treatment (1000×) یک آنتی بیوتیک ترکیبی است که شامل سه جزء با اثرات ضد میکروبی روی مایکوپلاسما است: کینولون ها، مشتقات تتراسایکلین و آنتی بیوتیک های ماکرولید. این معرف حذف مایکوپلاسما با مهار سنتز DNA و تولید پروتئین های ضروری برای رشد مایکوپلاسما، بدون آسیب رساندن به سلول ها، به پاکسازی موثر مایکوپلاسما دست می یابد. نجات سلول را به حداکثر می رساند و تلفات ناشی از آلودگی مایکوپلاسما را به حداقل می رساند.

ویژگی های محصول

سمیت کم: حداقل سمیت برای سلول ها، تضمین عدم تداخل با آزمایش های بعدی سلولی مانند سنجش ترانسفکشن و زنده ماندن.

پایداری بالا: معرف را می توان برای مدت طولانی در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری کرد و کارایی بالای خود را حفظ کرد.

استفاده آسان: به سادگی محصول را به محیط کشت آلوده به مایکوپلاسما اضافه کرده و انکوبه کنید.

بازیگری سریع: "نتایج فوری"، با اثرات قابل مشاهده به سرعت در عرض 3 روز.

طیف گسترده: قادر به حذف اکثر انواع مایکوپلاسماهای موجود در آزمایشگاه است.

شکل 6.تصویر آزمایش سمیت سلولی معرف حذف مایکوپلاسما

پیشگیری از مایکوپلاسما

در فرآیند کشت سلولی، آلودگی مایکوپلاسما اغلب رخ می دهد. با این حال، به دلیل ویژگی های منحصر به فرد آن، تشخیص آن با چشم غیر مسلح یا تجهیزات میکروسکوپی دشوار است. بنابراین، انجام یک کار خوب در پیشگیری از مایکوپلاسما بسیار مهم است. پیشگیری موثر از آلودگی مایکوپلاسما را می توان با افزودن معرف های پیشگیری کننده مایکوپلاسما به محیط کشت حاصل کرد.

در حال حاضر، مایکوپلاسما در آزمایشگاه‌ها عمدتاً از موارد زیر سرچشمه می‌گیرد: آلودگی متقاطع بین سلول‌ها، آلودگی محیط کار یا تجهیزات آزمایشگاهی، تکنیک‌های ضعیف آسپتیک توسط آزمایش‌کنندگان، محیط‌های کشت آلوده یا معرف‌ها، و بافت‌ها یا اندام‌های اصلی با آلودگی مایکوپلاسما. سری محصولات پیشگیری از مایکوپلاسما توسعه یافته توسط Yeasen دارای سادگی، راحتی و پایداری بالا است که آن را برای پیشگیری از مایکوپلاسما در کشت های معمولی سلولی بسیار مناسب می کند.

اطلاعات محصول

محصول	شماره کاتالوگ	نام محصول	مشخصات محصول
نمونه کیت پیش تصفیه	18461ES	کیت آماده سازی نمونه DNA باقیمانده مغناطیسی MolPure®	25T/100T
نمونه کیت پیش تصفیه	18467ES	کیت آماده سازی نمونه MolPure® Mag48 FN	3×16T/ 6×16T
ابزار استخراج اسید نوکلئیک	80511ES	استخراج کننده اسید نوکلئیک خودکار 48 کانالی	کانال 48
کیت تشخیص مایکوپلاسما	40619ES	کیت تشخیص qPCR بلادرنگ MycAway® Mycoplasma (2G)	25T/100T
	40612ES	کیت تشخیص مایکوپلاسما یک مرحله ای MycAway™ Plus-Color	25T/100T
	40601ES	کیت تست مایکوپلاسما GMyc-PCR	10 سنجش / 20 سنجش
معرف حذف مایکوپلاسما	40607ES	MycAway^TM درمان (1000×) - معرف حذف مایکوپلاسما	1 میلی لیتر / 5 × 1 میلی لیتر
معرف پیشگیری از مایکوپلاسما	40608ES	MycAway^TM پیشگیرانه (2000×) - معرف پیشگیری از مایکوپلاسما	1 میلی لیتر / 5 × 1 میلی لیتر
	40605ES	MycAway^TM اسپری (آماده مصرف)	500 میلی لیتر / 2 × 500 میلی لیتر / 10 × 500 میلی لیتر
	40609ES	MycGuard^TM-1 محلول (100×)، برای ضد عفونی حمام آب انکوباتور CO2	100 میلی لیتر
	40610ES	MycGuard^TM-2 محلول (500×)، برای ضد عفونی کردن حمام آب معمولی	100 میلی لیتر

مقاله قبلی مقاله بعدی