گزارش اعتبار سنجی DNA DNA میزبان CHO (3G) گزارش اعتبار سنجی

CHO کیت تشخیص باقیمانده DNA سلول میزبان (3جی)

خلاصه صلاحیت (شماره گربه: 41332ES60)

1. پس زمینه

داده های خلاصه شده در این گزارش توسط Yeasen Biotechnology برای CHO انجام شده است محصول Host Cell DNA Residue Detection Kit (3G). داده های خلاصه فقط برای مرجع کاربر است و کاربر باید باقیمانده سلول میزبان را تأیید کند. روش DNA با استفاده از نمونه های خود برای تایید روش می تواند نیازهای کاربر را برآورده کند. به کلیه آزمایشگاه هایی که از این کیت استفاده می کنند توصیه می شود پارامترهای زیر را بررسی کنند: خطی بودن، برد، دقت، دقت، حد کمیت، ویژگی و استحکام.

Yeasen Biotechnology می تواند گزارش صلاحیت دقیق این کیت را ارائه دهد. اگر کاربر از این گزارش استفاده کند، فقط مناسب بودن (که شامل دقت، دقت و ویژگی) باید تأیید شود.

2. مواد و روش های آزمایشی

2.1 CHO کیت تشخیص باقیمانده DNA سلول میزبان (3G)، فروشنده: Yeasen، Cat No.: 41332ES60.

2.2 کیت آماده سازی نمونه DNA باقیمانده مغناطیسی MolPure، فروشنده: Yeasen، Cat No.: 18461ES60.

2.3 داده های اصلی: نسخه الکترونیکی در "گزارش آزمایش" ثبت شد زیر فایل فایل والد CHO کیت تشخیص باقیمانده DNA سلول میزبان (3G).

2.4 روشها: مواد و روشهای عملیاتی مورد استفاده برای آزمایش اساساً توسط Yeasen Biotechnology تولید یا تنظیم شده است که برای مدت طولانی مورد ارزیابی و تأیید قرار گرفته است، توسعه و ساخت کیت از سیستم ISO 13485 پیروی می کند.

3. محتویات و نتایج صلاحیت

3.1 محدوده تشخیص

محدوده خطی کیت 3 fg/μL~300 pg/μL با R بود²= 1، و راندمان تقویت 99.09٪ با CV <15٪ برای هر سنجش غلظت بود.

شکل 1 منحنی استاندارد qPCR DNA (3G).

3.2 دقت

3.2.1 آراکاوری

3.2.1.1 نمونه خالی آزمایش بازیابی Spiking

نمونه های CHO استانداردهای DNA در غلظت های بالا و پایین: 30 pg/μL، 300 fg/μL و 3 fg/μL به ترتیب تهیه و پس از استخراج با استفاده از روش مهره مغناطیسی برای کیت پیش درمان نمونه DNA باقیمانده مورد سنجش قرار گرفت (3 تکرار استخراج برای هر نمونه انجام شد، و 3 تکرار سنجش برای هر استخراج انجام شد، و بازیابی نمونه و CVs مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

برای غلظت‌های مختلف نمونه‌های DNA، بازیابی‌ها از 70٪ تا 130٪ متغیر بود و CVها همه کمتر از 20٪ بودند.

نوع نمونه	تمرکز نظری	میانگین 1 را استخراج کنید	استخراج 2 به معنی	میانگین 3 را استخراج کنید	غلظت متوسط	CV	بازیابی
نمونه خالی	/	/	/		/	/	/
نمونه بازیابی 1	30 pg/μL	27.07	27.51	28.27	27.62	2.20٪	92.06٪
نمونه بازیابی 2	300 fg/μL	285.53	301.25	295.71	294.16	2.71٪	98.05٪
نمونه بازیابی 3	3 fg/μL	3.50	3.54	3.31	3.45	3.56٪	115.00٪

جدول 1 نمونه خالی بازیابی Spiking

3.2.1.2 شبیه سازی نمونه آزمایش بازیابی Spiking

نمونه هایی با همان غلظت (300 fg/μL DNA CHO) استخراج شد (3 تکرار استخراج برای هر نمونه و 3 تکرار سنجش برای هر استخراج انجام شد) با 5 محلول زمینه مختلف (پروتئین بالا، اسید نوکلئیک بالا، pH بالا و پایین، نمک بالا) و بازیابی نمونه ها و CV ها آنالیز شدند.

بازیابی نمونه DNA برای محلول های پس زمینه مختلف از 70٪ تا 130٪، با همه CV ها <20٪ متغیر بود.

نوع نمونه	تمرکز نظری	میانگین 1 را استخراج کنید	استخراج 2 به معنی	میانگین 3 را استخراج کنید	غلظت متوسط	CV	بازیابی
نمونه پایه	/	/	/		/	/	/
پروتئین بالا	300 fg/μL	302.29	332.86	342.76	325.97	6.47٪	108.66٪
اسید هسته ای بالا		284.47	290.66	308.76	294.63	4.28٪	98.21٪
پر نمک		272.96	286.25	312.91	290.71	7.00٪	96.90%
PH بالا		296.04	320.58	324.56	313.72	4.92٪	104.57٪
PH پایین		314.77	327.89	340.26	327.64	3.89٪	109.21٪

جدول 2 بازیابی اولیه نمونه اولیه

3.3 دقت

3.3.1 تکرارپذیری

آزمایش را 10 بار برای استانداردهای DNA CHO در غلظت 3 fg/μL با CV <15% تکرار کنید.

تکرارها	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	میانگین	CV%
مقدار تشخیص (fg/μL)	3.13	3.26	2.89	3.16	2.95	2.87	2.88	2.75	2.87	3.15	2.99	5.65٪

جدول 3 نتایج تکرارپذیری

3.3.2 دقت متوسط

سه آزمایش‌کننده به‌طور مستقل نمونه‌های استاندارد DNA CHO را در غلظت‌های بالا و پایین آزمایش کردند: 300 pg/μL، 3 pg/μL، و 3 fg/μL، و سه تکرار برای هر غلظت انجام شد، و CVs هر 9 داده به‌دست‌آمده کمتر از 15 درصد بود.

انقضا	تمرکز واقعی تمرکز نظری	CHO DNA (3G)
		300 pg/uL	3 pg/uL	3 fg/uL
انقضا 1	تعیین 1	302.63	2.97	3.40
	تعیین 2	294.54	3.01	3.14
	تعیین 3	287.67	2.99	3.01
Exp2	عزم 4	292.27	2.92	3.47
	عزم 5	299.61	2.90	2.82
	عزم 6	305.73	2.93	2.90
انقضا 3	عزم 7	301.06	3.17	3.15
	عزم 8	299.17	3.00	3.21
	عزم 9	290.66	2.90	3.05
/	میانگین	297.04	2.98	3.13
/	CV%	2.03	2.80	6.85

جدول 4 نتایج دقت متوسط

3.4 ویژگی

تداخل DNA ژنومی سلولی که معمولاً در تولید مواد بیولوژیک استفاده می‌شود از نظر تداخل با معرف‌های تشخیص DNA CHO ارزیابی شد و گروه تداخل با گروه کنترل همپوشانی داشت و هیچ تداخلی مشاهده نشد (شکل زیر به ترتیب داده‌های تداخل DNA‌های ژنومیک شناسایی موش، MDCK، HEK293 و E.coli را با DNAهای CHO را نشان می‌دهد).

شکل 2 نتایج آزمایش تداخل

3.5 محدودیت کمی

DNA CHO در 3 fg/μL، 1 fg/μL، 0.5 fg/μL، 0.3fg/uL و 0.1 fg/μL، با 10 تکرار برای هر غلظت شناسایی شد. نتایج نشان داد که CV کمتر از 20 درصد در غلظت های 0.3 fg/μL و بالاتر بود. یعنی حد کمیت کیت تشخیص باقیمانده DNA سلول میزبان CHO (3G) 0.3 fg/μL بود.

تکرارها مورد آزمایشی	CHO DNA (3G) (fg/μL)
	مقدار	نسبت محاسبه مجدد %
1	0.28	93.33٪
2	0.26	86.67٪
3	0.32	106.67٪
4	0.30	100.00%
5	0.33	110.00٪
6	0.23	76.67٪
7	0.29	96.67٪
8	0.37	123.33٪
9	0.31	103.33%
10	0.28	93.33٪
میانگین	0.30	/
CV%	13.09٪	/

شکل 3. CHO DNA (3G) نتیجه آزمایش qPCR

3.6 محدودیت تشخیص

DNA CHO در 0.3 fg/μL، 0.1 fg/μL، 0.05 fg/μL و 0.01 fg/μL، با 20 تکرار برای هر غلظت شناسایی شد. نتایج نشان داد که نرخ تشخیص ≥19 (یعنی نرخ تشخیص ≥95٪) در 20 چاه تکراری در غلظت‌های 0.05 fg/μL و بالاتر بود. یعنی حد تشخیص کیت تشخیص باقیمانده DNA سلول میزبان CHO (3G) 0.05 fg/μL بود.

شکل 4. نتیجه آزمایش qPCR DNA CHO (3G).

3.7 استحکام

این کیت آزمایش شده است و برای ابزارهای زیر مناسب است، اما محدود به آنها نیست:

فروشنده	مدل های ابزار	راندمان تقویت	آر2	حد کمیت	CV	حد تشخیص	نرخ تشخیص
ترمو	ABI 7500	99.69٪	1	0.3 fg/μL	12.40٪	0.05 fg/μL	95.65٪
ترمو	ABI QuantStudio5	99.26٪	1	0.3 fg/μL	15.30٪	0.05 fg/μL	100.00%
روشه	LightCycler480	2.05٪	0.978	0.3 fg/μL	/	0.05 fg/μL	/
شانگهای هونگشی	SLAN	101.14٪	0.999	0.3 fg/μL	14.41٪	0.05 fg/μL	95.65٪

جدول 5 نتایج تست تناسب ابزار

3.8 ثبات

3.8.1 پایداری انجماد و ذوب

کیت تشخیص باقیمانده DNA سلول میزبان CHO (3G) با انجماد و ذوب مکرر 10 بار مورد آزمایش قرار گرفت و عملکرد کیت تحت تأثیر قرار نگرفت.

شاخص های تست زمان انجماد-ذوب	پارامتر	زمان T0	10 بار منجمد-ذوب
پارامتر منحنی استاندارد	راندمان تقویت	95.70٪	98.62%
	آر2	1	1
حد کمیت (0.3 fg/μL)	CV	15.31٪	17.16٪
حد تشخیص (0.05 fg/μL)	نرخ تشخیص	95.65٪	100%

جدول 6 تجزیه و تحلیل نتایج پایداری انجماد- ذوب

3.7.2 پایداری تسریع شده

کیت تشخیص باقیمانده DNA سلول میزبان CHO (3G) به ترتیب در دمای 2 تا 8 درجه سانتی گراد به مدت 30 روز و 37 درجه سانتی گراد به مدت 14 روز نگهداری شد. هیچ یک از عملکرد کیت تحت تأثیر قرار نگرفت.

شاخص های تست دما و زمان شتاب	پارامتر	آزمایش 1		آزمایش 2
		زمان T0	2 ~ 8 ℃ 30 روزها	زمان T0	37 ℃ 14 روز
پارامتر منحنی استاندارد	راندمان تقویت	100.53٪	102.61٪	101.76٪	101.84٪
	آر2	1	1	1	1
حد کمیت (0.3 fg/μL)	CV	17.16٪	12.63٪	16.27٪	12.49
حد تشخیص (0.05 fg/μL)	نرخ تشخیص	95.65٪	100%	95.57٪	100%

جدول 7 تجزیه و تحلیل نتایج پایداری تسریع شده

3.9 حد خالی

3.9.1 بدون کنترل الگو (NTC)

بدون کنترل الگو (NTC) رقت DNA با 96 تکرار برای انجام سنجش کمی qPCR بود، تمام مقادیر CT بالاتر از 96 چاه تکراری آزمایش شده بیش از 40 بود.

شکل 5 نتایج آزمایش NTC

3.9.2 نمونه کنترل استخراج منفی (NCS)

نمونه کنترل استخراج منفی (NCS) رقت DNA بود، و ابتدا با پیش تیمار نمونه استخراج شد، سپس qPCR انجام شد، تمام مقادیر CT بالای 48 چاه تکرار آزمایش شده بیش از 40 بود.

شکل 6 NCS نتایج آزمایش

4. 4.مرجع

4.1 کمیسیون فارماکوپه چین (ChPC). فارماکوپه جمهوری خلق چین (جلد Ⅲ) [S]. پکن: انتشارات علوم و فناوری پزشکی چین، صفحه 542-543، 2020.

4.2 NMPA، 2007: اصول کلی برای بررسی فنی اعتبارسنجی روش تحلیلی برای کنترل کیفیت محصولات بیولوژیکی.

4.3 ICH (2022)《تأیید روش تحلیلی Q2》، نسخه پیش نویس.

اطلاعات سفارش