Previsto in qualche modo si possono raggiungere i seguenti obiettivi: monitoraggio in tempo reale della crescita tumorale nei topi nudi, sono state localizzate cellule tumorali iniettate nei topi sperimentali, per mostrare l'effetto del farmaco sui tumori in vivo. E ora abbiamo una serie di reagenti che ci permettono di farlo.
Figura 1: Localizzazione delle cellule marcate con luciferasi
Luciferasi: localizzatore cellulare
La luciferasi è una serie di enzimi che possono catalizzare i substrati per produrre bioluminescenza. Diverse fonti di luciferasi hanno le loro caratteristiche e diverse luciferasi possono catalizzare i substrati per emettere diversi colori di luce. La luciferasi di lucciola è diventata il reporter di cellule di mammifero più comunemente utilizzato tra questi enzimi a causa della sua elevata sensibilità e dell'ampio intervallo lineare di rilevamento (fino a 7-8 ordini di grandezza). L'effetto è che cellule specifiche possono essere tracciate e rilevate in qualsiasi momento in esperimenti successivi semplicemente inserendo il reporter una volta.
Figura 2: Il principio della reazione della luciferasi e del sale di potassio della luciferina luminescenza
I vantaggi dei metodi di imaging della luciferasi
Privo di radiazioni e praticamente innocuo per gli organismi viventi.
Imaging tramite bioluminescenza anziché tramite sorgente luminosa di eccitazione.
Elevata sensibilità: il numero di cellule rilevate può essere basso, pari a poche centinaia.
Buona penetrazione: il segnale di fluorescenza può essere rilevato anche attraverso 3-4 cm di tessuto.
Elevato rapporto segnale/rumore, forte segnale fluorescente, buona anti-interferenza.
Scenario applicativo
Monitoraggio della crescita del tumore
Osservazione in tempo reale della crescita del tumore in topi nudi in vivo, corpo tumorale senza separazione.
Monitoraggio della funzione dei farmaci tumorali
Per rilevare l'effetto dei farmaci sulla crescita del tumore o sulle metastasi tumorali in vivo. Il substrato di fluoresceina può essere completamente eliminato in 3 ore, quindi non interferirà con il farmaco.
Localizzazione cellulare
Sono state rilevate la localizzazione e la distribuzione di cellule estranee negli animali.
Regolazione dell'espressione genica
Il gene bersaglio o il promotore del gene bersaglio si fonde con il gene della luciferasi per rilevare cambiamenti nell'espressione genica durante il trattamento farmacologico o la progressione della malattia.
Ricerca sulle cellule staminali
Monitoraggio del trapianto, della sopravvivenza e della proliferazione delle cellule staminali; Tracciamento della distribuzione e della migrazione delle cellule staminali in vivo.
Risultati sperimentali
Figura 3: Rilevamento tramite imaging in vivo delle cellule T CAR-MUC1 T/CAR-MUC1-IL22 per la formazione di tumori mediante iniezione sottocutanea di cellule HN4 nei topi
Figura 5: Imaging in vivo della capacità delle cellule staminali mesenchimali (MSC) di migrare verso il sito dell'ustione. Le cellule staminali mesenchimali (MSC/FLuc) sono state iniettate per via endovenosa in un modello di ustione dorsale di topo. Segnali bioluminescenti sono apparsi nel sito della lesione della ferita da ustione 4 giorni dopo l'iniezione, per poi diminuire gradualmente (la freccia rossa indica il sito dell'ustione) [3].
Domande frequenti
D1: Quali sono i vantaggi dei metodi di imaging bioluminescente in vivo rispetto ad altri metodi simili?
R: Rispetto ad altri tipi di tecnologia, il metodo di imaging in vivo basato sulla bioluminescenza è più sensibile dei metodi tradizionali nello studio delle metastasi tumorali, nella terapia genica, nella patogenesi epidemiologica, nei traccianti delle cellule staminali, nella ricerca sulla leucemia, ecc.e può anche svolgere in modo rapido e intuitivo la ricerca sulla patogenesi e sullo screening farmacologico di malattie correlate attraverso una serie di modelli di malattie animali transgeniche.
D2: Come etichettare le cellule staminali con il gene della luciferasi?
UN: Con marcatori dell'espressione sessuale dei geni alla preparazione di topi transgenici, quali cellule staminali sono state marcate. Le cellule staminali ematopoietiche sono state estratte dal midollo osseo di tali topi transgenici e trapiantate nel midollo osseo di un altro topo per tracciare la proliferazione e la differenziazione delle cellule staminali ematopoietiche in vivo e il processo di migrazione verso l'intero corpo. Oppure è possibile marcare le cellule staminali con lentivirus.
D3: Qual è il tempo di rilevamento appropriato dopo l'iniezione di fluoresceina e quanto dura la luminescenza?
R: Dopo l'iniezione intraperitoneale, il segnale di fluorescenza ha generalmente raggiunto il periodo di stabilità più forte dopo 10-15 minuti, ha iniziato a decadere dopo 20-30 minuti ed ha eliminato la fluoresceina dopo 3 ore.
D4: Qual è il metodo di iniezione disponibile del reagente della luciferasi per gli esperimenti sui topi? Quali sono le differenze tra i diversi metodi di iniezione?
UN: La fluoresceina può essere iniettata nei topi tramite iniezione intraperitoneale o endovenosa nella coda. Può diffondersi a tutto il corpo dei topi in circa 1 min. Nella maggior parte dei casi si utilizzano concentrazioni di fluoresceina di 150 mg/kg. Circa 3 mg di fluoresceina sono sufficienti per topi da 20 g. Per l'iniezione intraperitoneale, la diffusione è più lenta, l'inizio della luce è più lento e la durata della luce è più lunga. Per l'iniezione endovenosa di fluoresceina nella coda, la diffusione è rapida e la luminescenza inizia rapidamente, ma la durata della luminescenza è breve.
Informazioni sul prodotto
| Nome del prodotto | Numero di catalogo | Specifiche |
| 40901ES01/02/03/08 | 100 mg/500 mg/1 g/5 g | |
| 40902ES01/02/03/09 | 100 mg/500 mg/1 g/5 g | |
| 40903ES01/02/03 | 100 mg/500 mg/1 g | |
| 40904ES02/03/08 | 1×500 μg/2×500 μg/5mg | |
| 40905ES02/03 | 1×500 μg/2×500 μg | |
| 40906ES02/03/08 | 1×500 μg/2×500 μg/5mg | |
| 40908ES02/03 | 1×500 μg/2×500 μg |
Riferimenti
[1]. Mei Z, Zhang K, Lam AK, Huang J, Qiu F, Qiao B, Zhang Y. MUC1 come bersaglio per la terapia CAR-T nel carcinoma squamocellulare della testa e del collo. Cancer Med. 2020 gennaio;9(2):640-652. doi: 10.1002/cam4.2733. Epub 2019 dicembre 4. PMID: 31800160; PMCID: PMC6970025.
[2]. Chen G, Fan XY, Zheng XP, Jin YL, Liu Y, Liu SC.Le cellule staminali mesenchimali umane derivate dal cordone ombelicale migliorano la resistenza all'insulina tramite il crosstalk mediato da PTEN tra le vie di segnalazione PI3K/Akt ed Erk/MAPK nei muscoli scheletrici dei topi db/db. Stem Cell Res Ther. 2020 16 settembre;11(1):401. doi: 10.1186/s13287-020-01865-7. PMID: 32938466; PMCID: PMC7493876.
[3]. Oh EJ, Lee HW, Kalimuthu S, Kim TJ, Kim HM, Baek SH, Zhu L, Oh JM, Son SH, Chung HY, Ahn BC. Migrazione in vivo di cellule staminali mesenchimali verso siti di ustione e loro effetti terapeutici in un modello murino vivente. J Control Release. 10 giugno 2018;279:79-88. doi: 10.1016/j.jconrel.2018.04.020. Epub 12 aprile 2018. PMID: 29655989.