Inleiding tot Apoptose
Apoptose is een geprogrammeerd celdoodfenomeen dat optreedt tijdens de ontwikkeling van een cel of wanneer deze wordt beïnvloed door bepaalde factoren, en wordt getriggerd door de regulatie van intracellulaire genen en hun producten. In het pad van apoptose vinden gebeurtenissen plaats in chronologische volgorde, één voor één, wat leidt tot de presentatie van apoptotische blaasjes, en vervolgens treedt apoptose op. Apoptose speelt een cruciale rol in embryonale ontwikkeling en morfogenese, het behoud van een stabiele populatie van normale cellen in weefsels, de verdediging en immuunreacties van het lichaam, cellulaire schade veroorzaakt door ziekte of intoxicatie, veroudering en de ontwikkeling van tumoren, en heeft potentiële therapeutische waarde.
Detectieprincipe
De verdeling van fosfolipiden in normale celmembranen is asymmetrisch. fosfatidylserine (PS) bevindt zich op het binnenoppervlak van het celmembraan in levende cellen, en tijdens apoptose ondergaat het celmembraan een verandering, en wordt PS omgedraaid van het binnenoppervlak van het celmembraan naar het buitenoppervlak van het celmembraan. Annexin V herkent PS specifiek op het oppervlak van apoptotische cellen, terwijl PS van levende cellen zich op het binnenoppervlak van het celmembraan bevindt en niet specifiek aan Annexin V kan binden.
De PS van necrotische cellen flipt ook van het binnenoppervlak van het celmembraan naar het buitenoppervlak van het celmembraan, en Annexin V herkent ook de PS op het oppervlak van necrotische cellen, dus Annexin V kan geen onderscheid maken tussen necrotische en apoptotische cellen. Daarentegen was PI-kleurstof in staat om te binden aan intracellulair DNA en onderscheid te maken tussen necrotische cellen en levende cellen. Het celmembraan van vroege apoptotische cellen en levende cellen is nog intact, en PI-kleurstof kan niet vrij door het celmembraan heen om de cel binnen te dringen en te binden aan het DNA, dus PI-kleurstof kan apoptotische cellen en levende cellen niet labelen, terwijl PI-kleurstof in staat is om door het celmembraan van de necrotische cellen te gaan en te binden aan het DNA in de cel, en de PI-kleurstof in de necrotische cellen zal rode fluorescentie uitzenden na te zijn geëxciteerd door de 488 nm laser, die zal worden ontvangen door het corresponderende kanaal. Dus Annexin V en PI kunnen gelijktijdig worden gebruikt om onderscheid te maken tussen levende cellen, vroege apoptotische cellen en late apoptotische of necrotische cellen.
Figuur 2 Principe van Annexin V/PI-detectie
Detectie van flowcytometrie
De maximale excitatiegolflengte van FITC bedraagt 488 nm, de maximale emissiegolflengte bedraagt 525 nm en de groene fluorescentie van FITC wordt gedetecteerd in het FL1-kanaal. De maximale excitatiegolflengte van het PI-DNA-complex is 535 nm, de maximale emissiegolflengte is 615 nm en de rode fluorescentie van PI wordt gedetecteerd in het FL2- of FL3-kanaal. De analyse werd uitgevoerd met software zoals CellQuest en er werd een tweekleurenspreidingsdiagram getekend met FITC als horizontale coördinaat en PI als verticale coördinaat. In typische experimenten kunnen de cellen worden verdeeld in drie subpopulaties, waarbij levende cellen alleen achtergrondfluorescentie met zeer lage intensiteit hebben, vroege apoptotische cellen alleen sterke groene fluorescentie hebben en late apoptotische cellen dubbele kleuring hebben met groene en rode fluorescentie.
Figuur 3 Flowcytometriedetectie
Veelgestelde vragen
V: Kan de Annexin V-apoptosetest worden toegepast op planten of bacteriën (prokaryoten)?
A: Ja, maar het is noodzakelijk om protoplasten te prepareren omdat plantencellen of bacteriën (prokaryoten) celwanden bevatten. De specifieke dosering van de kleuroplossing hoeft de cellen alleen maar onder te dompelen, en de kleurtijd is enigszins verschillend voor verschillende cellen.
V: Hoe kunnen we de uitkomst van het experiment beoordelen?
A: Levende cellen (Annexin V-/PI-), vroege apoptotische cellen (Annexin V+/PI-), late apoptotische cellen en necrotische cellen vertonen dubbele positiviteit (Annexin V+/PI+), naakte kernen (Annexin V-/PI+).
V: Wat is het verschil tussen Annexin V en TUNEL?
A: Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) is een kleuringsmethode die wordt gebruikt om intracellulaire DNA-fragmentatieplaatsen te identificeren - een kenmerkend kenmerk van late apoptose.
Met annexine V-kleuring worden de vroege stadia van apoptose herkend door binding aan PS-residuen die buiten de cel worden blootgesteld als gevolg van het verlies van de asymmetrie van het celmembraan.
V: Is het mogelijk om de test uit te voeren met alleen Annexin V-FITC zonder PI te detecteren?
A: Ja, dat is mogelijk. Voor speciale testmonsters, zoals rode bloedcellen zonder kernen, of het gebruik van het medicijn Doxorubicine (Adriamycine) dat de PI-detectie verstoort, is het mogelijk om de test uit te voeren met alleen Annexin V-FITC in beide gevallen.
Productdetails
| Productnaam | Artikelnr. | Specificatie |
| Annexin V-FITC/7-AAD Apoptose Detectiekit | 40311ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
| 40302ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| Annexin V-PE/7-AAD Apoptose Detectiekit | 40310ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
| 40303ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| Annexin V-YSFluor™ 488/7-AAD Apoptose Detectiekit | 40313ES60 | 100T |
| 40305ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| 40304ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| Annexin V-YSFluor™ 647/7-AAD Apoptose Detectie Kit | 40312ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
| 40306ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| 40307ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| 40308ES20/50/60 | 20T/50T/100T |