Mycoplasma, também conhecidos como organismos semelhantes à pleuropneumonia (PPLO), são os menores e mais simples procariotos descobertos até agora que não têm parede celular. Eles têm um diâmetro de 0,1 a 0,3 μm, podem passar por filtros e exibem alto pleomorfismo. Eles são contaminantes bacterianos relativamente comuns e difíceis de detectar em culturas de células de mamíferos
A contaminação por micoplasma tem múltiplos efeitos adversos em culturas de células e se tornou um problema sério nas práticas de cultura de células. Estima-se conservadoramente que a taxa de contaminação por micoplasma em culturas de células de rotina varia de 15% a 35%, o que interfere seriamente na credibilidade dos resultados experimentais.
Aproximadamente 95% da contaminação por micoplasma em culturas de células é causada principalmente por Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma arginini, Mycoplasma orale, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma hominis e Mycoplasma hyorhinis. Em meios de cultura, colônias de micoplasma formam uma aparência de "ovo frito". Sobrenadantes de cultura de células e membranas celulares fornecem um ambiente adequado para o crescimento de micoplasma, e micoplasmas que parasitam a superfície das células podem penetrar na membrana da célula hospedeira.
As principais fontes de contaminação por micoplasma incluem: meios de cultura de células ou seus componentes (como matérias-primas para o meio, soro e outros reagentes), pessoal de laboratório, incubadoras de cultura de células, tanques de armazenamento de nitrogênio líquido, partículas transportadas pelo ar e aerossóis, uso excessivo de antibióticos, culturas de células seladas incorretamente e células que já estão contaminadas com micoplasma.
Enquanto isso, os riscos correspondentes dessas contaminações incluem: levar ao descarte de lotes de produtos celulares ou produtos produzidos usando células como meio devido à incapacidade de remover efetivamente o micoplasma durante a purificação posterior; contaminar todos os equipamentos e instalações relacionados, bem como produtos intermediários ou finais, que entram em contato com o material contaminado; fazer com que outras células normais sejam contaminadas por micoplasma; resultar no descarte de importantes bancos de células ou sementes virais devido à contaminação por micoplasma; forçar o laboratório a interromper a produção ou as operações experimentais para lidar com a contaminação por micoplasma; levar ao desenvolvimento de resistência ao micoplasma, tornando-o ainda mais difícil de eliminar; expandir a área de contaminação por micoplasma; e representar uma ameaça a outras culturas de células no laboratório.
Portanto, testes e remoção regulares de micoplasma devem ser realizados para garantir que nenhum micoplasma esteja presente no sistema de cultura de células, o que é essencial para o progresso normal da pesquisa científica.
Micoplasma Detecção
Mycoplasma é um tipo de contaminação relativamente comum, mas tipicamente difícil de remover. Para processos biológicos envolvendo cultura de células, as regulamentações exigem que 'não deve haver contaminação por micoplasma.'
- A edição de 2020 da Farmacopeia Chinesa, Volume III, 'Preparação e Controle de Qualidade de Substratos de Células Animais para Produção e Teste de Produtos Biológicos', estipula que, para células usadas na produção, o teste de micoplasma deve ser conduzido no Banco Mestre de Células (MCB), Banco de Células de Trabalho (WCB) e Células em Fim de Produção (EOPC).
- FDA, Orientação para a Indústria: Caracterização e Qualificação de Substratos Celulares e Outros Materiais Biológicos Usados na Produção de Vacinas Virais para Indicações de Doenças Infecciosas, estipula que o controle de micoplasma deve ser realizado em matérias-primas, sementes de vírus, fluidos de colheita não processados e outros materiais semelhantes.
- O ICH Q5D, 'Derivação e caracterização de substratos celulares usados para produção de produtos biotecnológicos/biológicos', também menciona que o controle de micoplasma deve ser realizado em matérias-primas, sementes de vírus, fluidos de colheita não processados e outros materiais semelhantes.
Figura 1 Pontos de teste de contaminação por micoplasma exigidos por regulamentações nacionais e internacionais
Os métodos tradicionais de detecção de micoplasma incluem principalmente métodos de cultura e métodos de células indicadoras. No entanto, devido aos longos ciclos de detecção ou problemas de sensibilidade desses dois métodos, eles levam a ciclos de produção ou liberação de produtos estendidos para as empresas. Com o desenvolvimento da terapia celular e genética, os requisitos da indústria para a pontualidade e sensibilidade da detecção de micoplasma tornaram-se cada vez mais rigorosos. Vidas de prateleira curtas são insuficientes para suportar períodos de detecção tão longos, razão pela qual o método NAT (Nucleic Acid Testing) rápido se destacou entre vários métodos de detecção de micoplasma.
Figura 2 Métodos de detecção de micoplasma listados em regulamentações nacionais e internacionais
Com base em NAT (técnicas de amplificação de ácido nucleico), a
É um produto para a rápida detecção qualitativa de contaminação potencial por micoplasma em matérias-primas de produção, bancos de células, sementes virais, fluidos de colheita viral ou celular e células terapêuticas. É usado principalmente nos processos de pesquisa, desenvolvimento, produção e liberação de biofármacos.
Qualificações do produto
Conformidade regulatória: Validado de acordo com os requisitos das farmacopeias EP2.6.7, JP G3 e USP 63, atendendo aos padrões de organizações internacionais autorizadas.
Conformidade de auditoria: A produção do produto está em conformidade com os padrões do sistema de gestão de qualidade ISO13485 e é apoiada por documentação de auditoria abrangente.
Garantia de qualidade: Todas as matérias-primas enzimáticas necessárias para o kit são de produção própria e foram industrializadas, garantindo um fornecimento estável.
Acúmulo de experiência técnica: Há uma base técnica sólida no método TaqMan, e a sensibilidade do kit pode chegar a 10 UFC/mL e menos.
Foco no desempenho do produto: A biblioteca de anticorpos da enzima Taq, com anticorpos de bloqueio duplo, aumenta a especificidade, a sensibilidade e a estabilidade do kit.
Características do produto
Vários tipos de detecção: Sondas TaqMan otimizadas podem detectar até 183 espécies de micoplasma.
Fácil de usar: O tempo total para preparação e teste da amostra é inferior a 3 horas, eliminando a necessidade de espera de 28 dias associada aos métodos de cultura.
Alta sensibilidade: O limite de detecção é tão baixo quanto 10 UFC/mL, o que o torna uma alternativa viável aos métodos de cultura direta.
Alta especificidade: Os primers e sondas são projetados visando o rRNA 16S, garantindo que não haja reação cruzada com espécies intimamente relacionadas, como clostrídios e lactobacilos.
Alta segurança: O controle positivo (PC) no kit não é infeccioso, eliminando completamente o risco de contaminação.
Forte resistência à interferência: A introdução de um controle interno (CI) ajuda a excluir interferências e anormalidades na amostra na preparação da reação, evitando efetivamente falsos negativos.
Figura 3 Fluxo de trabalho para detecção de micoplasma usando o kit de detecção de qPCR em tempo real de micoplasma
2.MycAway™ Plus-Color Kit de detecção de micoplasma em uma etapaEle emprega uma tecnologia de amplificação isotérmica exclusiva, oferecendo maior discriminação de cores. A mudança de azul-violeta (negativo) para azul-celeste (positivo) é mais facilmente discernível a olho nu. Além disso, inclui componentes anticontaminação para eliminar a ocorrência de falsos positivos.
Figura 4: Procedimento operacional para detecção de micoplasma usando o kit de detecção de micoplasma em uma etapa MycAway™ Plus-Color
3.GMyc-PCR Micoplasma DetecçãoKitDiferentemente dos métodos convencionais de detecção de PCR de uma etapa, o número de primers é aumentado de um par para três pares, visando as regiões conservadas do rRNA 16S e 23S do micoplasma para amplificação de PCR aninhada. Isso não apenas reduz produtos não específicos, mas também aumenta significativamente a sensibilidade do produto, permitindo a detecção de apenas uma única cópia do micoplasma.
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Figura 5 Procedimento operacional para detecção de micoplasma usando o kit de teste de micoplasma GMyc-PCR
Remoção de micoplasma
No processo de cultura de células, testes regulares podem efetivamente prevenir contaminação em larga escala por micoplasma. No entanto, se as células já estiverem contaminadas com micoplasma, elas precisam ser manuseadas prontamente. A melhor prática é esterilizar as células contaminadas sob alta pressão e então descartá-las para evitar contaminar outras linhagens celulares limpas. Se as células contaminadas forem particularmente valiosas e for necessário remover a contaminação por micoplasma, uma combinação de antibióticos pode ser usada para atingir esse objetivo. Como os micoplasmas não têm parede celular, os antibióticos tradicionais são geralmente ineficazes contra eles. Portanto, selecionar um reagente de remoção de micoplasma apropriado é crucial.
O tratamento MycAway™ da
Características do produto
Baixa toxicidade: Toxicidade mínima para as células, garantindo nenhuma interferência em experimentos celulares subsequentes, como transfecção e ensaios de viabilidade.
Alta estabilidade: O reagente pode ser armazenado por um longo período a -20°C e manter sua alta eficácia.
Fácil de usar: Basta adicionar o produto ao meio de cultura contaminado com micoplasma e incubar.
Ação rápida: 'Resultados imediatos', com efeitos visíveis em até 3 dias.
Amplo espectro: Capaz de remover a maioria dos tipos de micoplasma encontrados em laboratórios.
Figura 6.Ilustração do teste de citotoxicidade do reagente de remoção de micoplasma
Prevenção de micoplasma
No processo de cultura de células, a contaminação por micoplasma ocorre frequentemente. No entanto, devido às suas características únicas, é difícil de detectar a olho nu ou com equipamento microscópico. Portanto, é particularmente importante fazer um bom trabalho na prevenção de micoplasma. A prevenção eficaz da contaminação por micoplasma pode ser alcançada adicionando reagentes de prevenção de micoplasma ao meio de cultura.
Atualmente, o micoplasma em laboratórios se origina principalmente de: contaminação cruzada entre células, contaminação do ambiente de trabalho ou equipamento de laboratório, técnicas assépticas precárias por experimentadores, meios de cultura ou reagentes contaminados e tecidos ou órgãos originais com contaminação por micoplasma. A série de produtos de prevenção de micoplasma desenvolvida pela
Informações do produto
| Produto | Número de catálogo | Nome do produto | especificação do produto |
| Kit de pré-tratamento de amostra | 18461ES | Kit de preparação de amostra de DNA residual magnético MolPure® | 25T/100T |
| 18467ES | Kit de preparação de amostra MolPure® Mag48 FN | 3×16T/ 6×16T | |
| Instrumento de extração de ácido nucleico | 80511ES | Extrator de ácido nucleico automatizado de 48 canais | 48 canais |
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Kit de detecção de micoplasma | 40619ES | Kit de detecção de qPCR em tempo real de micoplasma MycAway® (2G)
| 25T/100T |
| 40612ES | Kit de detecção de micoplasma em uma etapa MycAway™ Plus-Color | 25T/100T | |
| 40601ES | 10 ensaios/20 ensaios | ||
| Reagente para remoção de micoplasma | 40607ES | MeucAwayTM Tratamento (1000×) - Reagente para remoção de micoplasma | 1 mL/5×1 mL
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Reagente de prevenção de micoplasma | 40608ES | MeucAwayTM Profilático (2000×) - Reagente de prevenção de micoplasma | 1 mL/5×1 mL
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| 40605ES | MeucAwayTM Spray (Pronto para uso) | 500 mL/2×500 mL/10×500 mL
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| 40609ES | MeucGuardaTM-1 Solução (100×), para Desinfecção de Banho-maria de Incubadora de CO2 | 100mL | |
| 40610ES | MeucGuardaTM-2 Solução (500×), para Desinfetar Banho-maria Comum | 100mL |