Introdução à Apoptose
Apoptose é um fenômeno de morte celular programada que ocorre durante o desenvolvimento de uma célula ou quando ela é afetada por certos fatores, e é desencadeada pela regulação de genes intracelulares e seus produtos. Na via da apoptose, os eventos ocorrem em ordem cronológica, um por um, levando à apresentação de vesículas apoptóticas, e então ocorre a apoptose. A apoptose desempenha um papel crucial no desenvolvimento embrionário e morfogênese, na manutenção de uma população estável de células normais em tecidos, na defesa do corpo e nas respostas imunológicas, nos danos celulares causados por doenças ou intoxicações, no envelhecimento e no desenvolvimento de tumores, e tem potencial valor terapêutico.
Princípio de detecção
A distribuição de fosfolipídios em membranas celulares normais é assimétrica. A fosfatidilserina (PS) está localizada na superfície interna da membrana celular em células vivas e, durante a apoptose, a membrana celular sofre uma mudança, e a PS é invertida da superfície interna da membrana celular para a superfície externa da membrana celular. A anexina V reconhece especificamente a PS na superfície de células apoptóticas, enquanto a PS de células vivas está localizada na superfície interna da membrana celular e é incapaz de se ligar especificamente à anexina V.
O PS de células necróticas também muda da superfície interna da membrana celular para a superfície externa da membrana celular, e a anexina V também reconhece o PS na superfície de células necróticas, então a anexina V é incapaz de distinguir entre células necróticas e apoptóticas. Em contraste, o corante PI foi capaz de se ligar ao DNA intracelular e distinguir entre células necróticas e células vivas. A membrana celular de células apoptóticas iniciais e células vivas ainda está intacta, e o corante PI não pode passar livremente pela membrana celular para entrar na célula e se ligar ao DNA, então o corante PI não pode marcar células apoptóticas e células vivas, enquanto o corante PI é capaz de passar pela membrana celular das células necróticas e se ligar ao DNA dentro da célula, e o corante PI nas células necróticas emitirá fluorescência vermelha após ser excitado pelo laser de 488 nm, que será recebido pelo canal correspondente. Então a anexina V e o PI podem ser usados simultaneamente para distinguir entre células vivas, células apoptóticas iniciais e células apoptóticas ou necróticas tardias.
Fig. 2 Princípio de detecção de anexina V / PI
Detecção por Citometria de Fluxo
O comprimento de onda máximo de excitação do FITC é 488 nm, o comprimento de onda máximo de emissão é 525 nm e a fluorescência verde do FITC é detectada no canal FL1. O comprimento de onda máximo de excitação do complexo PI-DNA é 535 nm, o comprimento de onda máximo de emissão é 615 nm, e a fluorescência vermelha do PI é detectada no canal FL2 ou FL3. A análise foi realizada com software como o CellQuest, e um gráfico de dispersão de duas cores foi desenhado com FITC como coordenada horizontal e PI como coordenada vertical. Em experimentos típicos, as células podem ser divididas em três subpopulações, com células vivas tendo apenas fluorescência de fundo de intensidade muito baixa, células apoptóticas iniciais tendo apenas fluorescência verde forte, e células apoptóticas tardias tendo coloração dupla com fluorescência verde e vermelha.
Fig.3 Detecção por citometria de fluxo
Perguntas frequentes
P: O ensaio de apoptose da anexina V pode ser aplicado a plantas ou bactérias (procariontes)?
R: Sim, mas é necessário preparar protoplastos porque células vegetais ou bactérias (procariontes) contêm paredes celulares. A dosagem específica da solução de coloração precisa apenas submergir as células, e o tempo de coloração é um pouco diferente para células diferentes.
P: Como julgar o resultado do experimento?
A: Células vivas (Anexina V-/PI-), células apoptóticas iniciais (Anexina V+/PI-), células apoptóticas tardias e células necróticas apresentam dupla positividade (Anexina V+/PI+), núcleos nus (Anexina V-/PI+).
P: Qual é a diferença entre Anexina V e TUNEL?
R: A marcação da extremidade de corte da desoxinucleotidil transferase terminal dUTP (TUNEL) é um método de coloração usado para identificar locais de fragmentação de DNA intracelular - uma característica marcante da apoptose tardia.
A coloração com anexina V reconhece os estágios iniciais da apoptose ligando-se a resíduos de PS expostos fora da célula devido à perda de assimetria da membrana celular.
P: É possível realizar o ensaio usando apenas Anexina V-FITC sem detectar PI?
R: Sim, é possível. Para amostras de teste especiais, como hemácias sem núcleos, ou o uso do medicamento Doxorubicina (Adriamicina) que interfere na detecção de PI, é possível realizar o ensaio usando apenas Anexina V-FITC em ambos os casos.
Detalhes do produto
| Nome do produto | Item nº. | Especificação |
| Kit de detecção de apoptose de anexina V-FITC/7-AAD | 40311ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
| 40302ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| Kit de detecção de apoptose de anexina V-PE/7-AAD | 40310ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
| 40303ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| Kit de detecção de apoptose Annexin V-YSFluor™ 488/7-AAD | 40313ES60 | 100T |
| 40305ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| 40304ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| Kit de detecção de apoptose Annexin V-YSFluor™ 647/7-AAD | 40312ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
| 40306ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| 40307ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| 40308ES20/50/60 | 20T/50T/100T |