PCR direta é uma reação que usa diretamente sangue, tecido animal ou vegetal, etc., para amplificação sem etapas para extração de ácido nucleico e purificação de ácido nucleico. Ela traz conveniência sem precedentes para amplificação de DNA, o que pode economizar muito tempo. Então, quais são os reagentes e produtos usados ​​na PCR direta?

1. O que é PCR direto
2. Quais reagentes são necessários para PCR direta
3. Cenários de aplicação e características do kit Direct PCR
4. Dados do produto
5. Feedback do cliente
6. Informações sobre pedidos de produtos

1. O que é PCR direto

Após suplementação e melhoria contínuas por inúmeros acadêmicos ao redor do mundo, a tecnologia de PCR se tornou o método de pesquisa básica mais amplamente utilizado, mais frequentemente utilizado e mais importante em todo o campo das ciências biológicas. Touch Down PCR, RT-PCR, PCR em tempo real, Multi PCR, etc. desenvolvidos com base na ampla aplicação da tecnologia tradicional de PCR, bem como o mais recente PCR Digital (PCR Digital), enriqueceram muito a pesquisa da maioria dos pesquisadores científicos. Esses métodos aceleraram muito o desenvolvimento das ciências biológicas modernas, especialmente a biologia molecular, e fizeram grandes contribuições para a pesquisa da vida e da natureza para todo o ser humano. A tecnologia tradicional de PCR e várias novas tecnologias e novas aplicações derivadas dela têm um pré-requisito, ou seja, modelos de ácido nucleico de alta pureza precisam ser obtidos com antecedência. Qualquer amostra biológica precisa passar por uma série de processamentos de amostra complexos e tediosos para obter amostras de ácido nucleico que atendam aos requisitos técnicos da PCR. A separação e extração de DNA e RNA sempre foram o trabalho básico que o pessoal científico e técnico relevante precisa repetir todos os dias. Devido à enorme diferença entre amostras, o processo de separação e extração de DNA e RNA também é muito diferente. Este trabalho requer um alto nível de proficiência técnica para os operadores. Devido ao uso de alguns reagentes químicos altamente tóxicos na tecnologia tradicional de separação e extração, a exposição a longo prazo causará danos irreversíveis ao corpo do operador e até mesmo danos diretos durante o experimento. Reagentes químicos como fenol e clorofórmio são importantes carcinógenos em laboratório, e o nitrogênio líquido usado no processo de separação de ácido nucleico e extração de tecidos vegetais representa uma ameaça maior à segurança dos operadores durante o experimento devido à sua temperatura ultrabaixa. Ao mesmo tempo, para aqueles que têm um grande número de amostras para estudar, separar e extrair ácidos nucleicos é uma tarefa trabalhosa. Agora, os kits de isolamento e extração de ácido nucleico no mercado estão maduros e há muitas marcas, mas são todos praticamente iguais. Seja um kit centrífugo de coluna de membrana de sílica ou um kit de método de esfera magnética, muito tempo é necessário e o custo é alto. Além do custo do kit, há requisitos especiais para equipamentos de laboratório. A estação de trabalho automatizada usada no método de esferas magnéticas é um equipamento de alto valor em larga escala muito típico, o que é uma despesa enorme para o laboratório. Para resumir, antes de realizar experimentos de PCR, o pré-tratamento da amostra é uma dor de cabeça inevitável e constante para os pesquisadores. Como resolver esse problema e realizar diretamente experimentos de PCR sem separação e extração de ácidos nucleicos sempre foi um problema em que muitos pesquisadores científicos e pessoal de laboratório clínico têm pensado.

PCR direta é uma reação na qual tecidos animais ou vegetais são usados ​​diretamente para amplificação sem extração de ácido nucleico. De muitas maneiras, a PCR direta funciona como a PCR convencional.A principal diferença é o buffer personalizado usado na PCR direta. A amostra pode ser diretamente submetida à reação de PCR sem extração de ácido nucleico, mas há requisitos correspondentes para a tolerância das enzimas envolvidas na reação de PCR direta e a compatibilidade do buffer. Embora haja mais ou menos inibidores de PCR em amostras comuns, a PCR direta ainda pode atingir amplificação confiável sob a ação de enzimas e tampões. No entanto, a reação de PCR tradicional precisa usar ácido nucleico de alta qualidade como um modelo para a reação. Se o modelo contiver proteínas e outras impurezas, ele inibirá o progresso suave da reação de PCR.

O campo de aplicação mais antigo da PCR direta é o campo de animais e plantas, como sangue, tecido e cabelo de camundongos, gatos, galinhas, coelhos, ovelhas, gado e outros animais; folhas e sementes de plantas, etc. É usado para estudar genotipagem, transgênicos, detecção de plasmídeos, análise de knockout de genes, identificação de fonte de DNA, identificação de espécies, análise de SNP e outros campos. Esses campos têm algumas características comuns, ou seja, o conteúdo do gene alvo é relativamente alto e a extração de ácido nucleico é problemática. Portanto, a PCR direta pode não apenas economizar tempo e ter pouco impacto nos resultados, mas também economizar custos.

2. Quais reagentes são necessários para PCR direta

2.1 Lisado de amostra

O lisado de amostra pode ser preparado por você mesmo ou comprado. A diferença nos componentes de diferentes marcas de lisado fará com que a capacidade de lise seja diferente, e então o tempo de lise será ligeiramente diferente. Por exemplo, para a preparação de amostras de tecido animal, geralmente é recomendado lisar por 30 minutos ou durante a noite, e o lisado para vírus varia de 3 a 10 minutos.

2.2 Mistura mestre de PCR

É recomendado usar uma DNA polimerase de partida a quente para aumentar a amplificação específica e uma capacidade de amplificação mais forte. No coração da PCR direta está uma polimerase altamente resistente.

2.3 Remover ou inibir componentes em amostras que afetam a amplificação do DNA

Após a amostra ser processada pelo lisado, proteínas, lipídios e outros detritos celulares serão liberados, e essas substâncias inibirão a reação de PCR. Portanto, a PCR direta precisa adicionar remoção ou inibidores correspondentes para reduzir a influência desses fatores.

3. Cenários de aplicação e características do kit Direct PCR

O kit de PCR direto da Yeasen pode amplificar diretamente as amostras da planta, tecido animal ou sangue, e outras amostras originais sem purificação de ácido nucleico, o que simplifica muito o processo experimental de PCR. A genotipagem baseada em PCR (Figura 1) foi realizada usando a amostra original sem purificação do genoma (Figura 1A) ou usando seu lisado (Figura 1B) como um modelo. Comparado com a genotipagem baseada em PCR geral, o kit de PCR direto tem menor consumo de amostra, operação simples, baixo custo experimental e detecção quantitativa de amostra de alta qualidade.

Figura 1. Tecnologia de PCR direta.

A. Método direto: Pegue um pequeno número de amostras e adicione-as diretamente à PCR Mix para identificação por PCR. B. Método de lise: Adicione a amostra à solução de lise para liberar o genoma e adicione uma pequena quantidade do sobrenadante de lise à PCR Mix para identificação por PCR.

3.1 Aplicações

Detecção de amplificação de genes animais, genotipagem de animais transgênicos, identificação de plantas transgênicas, genotipagem de plantas, etc.

3.2 Características

★   Direto: sem purificação de DNA;
★   Rápido: 10 min para concluir a preparação do modelo, 50 min para concluir a reação de PCR;
★   Simples: as amostras podem ser lisadas sem cisalhamento ou trituração;
A mistura PCR está na forma de uma mistura mestre, o que reduz as etapas de adição de amostras
★   Economia: menor consumo de material
★   Alto rendimento: a reação de lise pode ser concluída em placa de 96 poços
★   Forte tolerância ao inibidor

4. Dados do produto

4.1 Tipo universal multi-animal: Kit de PCR direto de tecido animal

4.1.1 Mais rápido: encurtar o tempo de operação

Figura 2. Um kit de PCR direto de tecido animal da Yeasen poderia economizar mais tempo.

4.1.2 Exemplo: Identificação do genótipo de camundongos knockout

Figura 3. Resultados da amplificação direta do kit de PCR direto de tecido animal para detecção de animais com gene knockout.

M: Escada de DNA de 100 pb. Faixas 1-8: lisado como molde. +: 50 ng DNA genômico purificado como molde. ﹣: Água deionizada como molde. Vários ciclos: 35 ciclos. Fragmento único (580 pb): Genoma homozigoto de animal knockout. Fragmento único (180 pb): Genoma de tipo selvagem. Dois fragmentos (580 pb/180 pb): Genoma heterozigoto de animal knockout.

4.2 Específico para roedores: Kit de PCR direto em tecido de camundongo

4.2.1 Mais rápido: Liberação de genes suficiente

Figura 4 Resultados de amplificação direta do kit de PCR direto de tecido de camundongo com diferentes tempos de lise.

M: 100bp DNA ladder. +: 50 ng de DNA genômico purificado como molde. Vários ciclos: 35 ciclos.

4.2.2 Melhor que o método geral de lise alcalina

Figura 5. Resultados da amplificação do gene SOX21 da cauda do camundongo tratado com diferentes métodos de lise.

M: Escada de DNA de 100 pb. Faixas 1-2: Lisado como molde por lise alcalina geral. Faixas 3-4: Lisado como molde por kit de PCR direto de tecido de camundongo. +: 50 ng de DNA genômico purificado como molde. -: Água deionizada como molde. Vários ciclos: 35 ciclos.

4.2.3 Comparar com produtos similares

Figura 6. Resultados da amplificação do gene SOX21 da cauda de camundongo tratada com produtos semelhantes de marcas diferentes.

M: 100 bp DNA ladder. +: 50 ng de DNA genômico purificado como molde. Vários ciclos: 35 ciclos.

4.3 Kit de PCR direto de tecido vegetal

4.3.1 Verificação de amostras de plantas multitipo

Figura 7. Resultados da amplificação direta de folhas de diferentes plantas.

M: Escada de DNA de 100 pb. C: O DNA genômico purificado como molde.Faixas 1-2: O lisado do tecido foliar como molde. Vários ciclos: 30 ciclos.

5. Feedback do cliente

5.1 Genotipagem de camundongos

Figura 8. Resultados da identificação do genótipo do camundongo usando o kit de PCR direto de tecido de camundongo por usuários da Beijing Jishi Life Technology Co., Ltd.

5.2 PCR direto de arroz

Figura 9. Amplificação de genes relacionados ao arroz usando kits de PCR direto de tecido vegetal por usuários da Universidade Agrícola de Huazhong.

6. Informações sobre pedidos de produtos

A Yeasen é uma empresa de biotecnologia engajada na pesquisa, desenvolvimento, produção e vendas de três principais reagentes biológicos: moléculas, proteínas e células. Os produtos fornecidos pela Yeasen são os seguintes.

Tabela 1. Informações sobre pedidos de produtos