Trong những năm gần đây, với sự phát triển nhanh chóng của y sinh học, sự xuất hiện của liệu pháp tế bào và gen trong đại dịch COVID-19 và sự ra đời của vắc-xin mRNA, việc đảm bảo tính an toàn và độ tin cậy của các sản phẩm sinh học đã trở thành trọng tâm của các chính phủ và cơ quan quản lý trên toàn thế giới. Nhiễm Mycoplasma là một loại nhiễm phổ biến nhưng thường khó loại bỏ. Các yêu cầu về quy định bắt buộc "đảm bảo không có nhiễm mycoplasma" đối với các quy trình sinh học liên quan đến nuôi cấy tế bào.
Yêu cầu của các cơ quan quản lý đối với xét nghiệm Mycoplasma:
- "Hướng dẫn cho ngành công nghiệp: Đặc tính và đánh giá chất nền tế bào và các vật liệu sinh học khác được sử dụng trong sản xuất vắc-xin vi-rút để điều trị bệnh truyền nhiễm" của FDA quy định việc kiểm soát mycoplasma đối với nguyên liệu thô, hạt giống vi-rút và dịch thu hoạch chưa qua chế biến.
- Phiên bản năm 2020 của Dược điển Trung Quốc Phần III "Chuẩn bị và kiểm soát chất lượng chất nền tế bào động vật dùng để thử nghiệm sản xuất sản phẩm sinh học" yêu cầu phải thử nghiệm mycoplasma đối với tế bào sản xuất, bao gồm Ngân hàng tế bào chính (MCB), Ngân hàng tế bào hoạt động (WCB) và Tế bào cuối sản xuất (EOPC).
- "Hướng dẫn kỹ thuật cho nghiên cứu dược phẩm và đánh giá các sản phẩm liệu pháp tế bào miễn dịch (thử nghiệm)" khuyến nghị tiến hành thử nghiệm liên quan đến an toàn mycoplasma trên các mẫu trung gian phù hợp tại các thời điểm quan trọng hoặc triển khai các biện pháp kiểm soát có liên quan. Thử nghiệm mycoplasma cũng được yêu cầu như một thử nghiệm phát hành cho các sản phẩm cuối cùng.
Xét nghiệm axit nucleic (NAT) và các phương pháp truyền thống:
Trước khi các phương pháp phát hiện nhanh như Công nghệ khuếch đại axit nucleic (NAT) ra đời, các phương pháp nuôi cấy truyền thống và xét nghiệm tế bào chỉ thị đã được sử dụng. Tuy nhiên, do chu kỳ phát hiện dài hoặc các vấn đề về độ nhạy, các phương pháp này thường kéo dài chu kỳ sản xuất hoặc giải phóng hoặc đòi hỏi phải giải phóng có điều kiện các vật liệu tế bào dựa trên đánh giá rủi ro hoặc khám phá các phương pháp thay thế. Với sự tiến bộ của liệu pháp tế bào và gen, nhu cầu ngày càng tăng trong ngành đối với các phương pháp phát hiện mycoplasma với độ kịp thời và độ nhạy cao hơn. Thời hạn sử dụng ngắn của sản phẩm không thể duy trì thời gian thử nghiệm dài, do đó các phương pháp NAT đã nổi lên như các giải pháp thay thế thuận lợi.
Hiện nay, Dược điển Châu Âu (EP) <2.6.7>, Dược điển Nhật Bản (JP) và Dược điển Hoa Kỳ (USP) <63> đều đã đưa phương pháp NAT vào làm phương pháp phát hiện mycoplasma. Tuy nhiên, việc xác nhận phương pháp này và so sánh với các phương pháp truyền thống để đảm bảo độ nhạy của nó không kém là điều kiện tiên quyết để sử dụng phương pháp này. Mặc dù ấn bản năm 2020 của Dược điển Trung Quốc (ChP) không đưa NAT vào làm phương pháp phát hiện mycoplasma, nhưng ấn bản này có đề cập đến khả năng sử dụng "các phương pháp khác được cơ quan quản lý thuốc quốc gia công nhận". Vào tháng 5 năm 2022, Trung tâm Đánh giá Thuốc của Cục Quản lý Sản phẩm Y tế Quốc gia (NMPA) đã ban hành "Hướng dẫn Kỹ thuật về Nghiên cứu Dược phẩm và Đánh giá Sản phẩm Liệu pháp Tế bào Miễn dịch (Thử nghiệm)", trong đó đề xuất xem xét phát triển các phương pháp phát hiện mycoplasma và vô trùng mới để thử nghiệm giải phóng trong những trường hợp đặc biệt khi thể tích mẫu bị hạn chế hoặc cần giải phóng nhanh và các phương pháp dược điển không đủ. Do đó, phương pháp NAT dự kiến sẽ ngày càng được nhiều nhà cung cấp nguyên liệu thô và các công ty sản xuất thuốc điều trị tiên tiến (ATMP) sử dụng như một phương pháp có khả năng hỗ trợ thử nghiệm giải phóng mycoplasma nhanh chóng.
Phương pháp NAT - Yêu cầu xác thực phương pháp
Quá trình xác nhận cho phương pháp NAT được mô tả chi tiết trong Dược điển Châu Âu <2.6.7> và Dược điển Nhật Bản, với nội dung về cơ bản là nhất quán. Viện Kiểm soát Thực phẩm và Dược phẩm Quốc gia (NIFDC) cũng đã xuất bản một bài báo có tiêu đề "Những cân nhắc về Phương pháp Phát hiện Axit Nucleic và Xác nhận Phương pháp cho Kiểm tra Mycoplasma", nhằm mục đích cung cấp hướng dẫn cho các nhà phát triển và người dùng các phương pháp khuếch đại axit nucleic mycoplasma ở Trung Quốc. Độ đặc hiệu, Giới hạn Phát hiện và Độ mạnh là những yếu tố thiết yếu để xác nhận các phương pháp NAT mycoplasma. Nếu sử dụng bộ dụng cụ thương mại để phát hiện mycoplasma, có thể tiến hành xác nhận tính phù hợp của phương pháp dựa trên báo cáo hiệu suất bộ dụng cụ toàn diện của nhà cung cấp, kết hợp với môi trường phòng thí nghiệm và loại mẫu.
Tính đặc hiệu:
Độ đặc hiệu đề cập đến khả năng của một phương pháp phân tích để xác định chính xác chất phân tích khi có các thành phần khác (như tạp chất, sản phẩm phân hủy, tá dược, v.v.). EP nhấn mạnh nhu cầu tập trung vào các phản ứng chéo giữa các loài vi khuẩn khác có liên quan chặt chẽ với cây phát sinh loài, chẳng hạn như Clostridium, Lactobacillus và Streptococcus trong vi khuẩn Gram dương. Cũng cần chú ý đến các loại chất gây ô nhiễm phổ biến như nhiễm DNA của con người trong tế bào vật chủ và môi trường thử nghiệm.
Giới hạn phát hiện:
Giới hạn phát hiện là lượng chất phân tích thấp nhất có thể phát hiện được trong mẫu. Nó đóng vai trò là cơ sở nhận dạng định tính và không cần định lượng dưới dạng giá trị chính xác. EP yêu cầu 24 điểm dữ liệu phát hiện cho mỗi loài mycoplasma ở mỗi nồng độ pha loãng. Điều này có thể đạt được bằng cách thực hiện ba lần pha loãng tuần tự 10 lần độc lập vào những ngày khác nhau, với tám lần phát hiện lặp lại cho mỗi gradient pha loãng hoặc bằng cách thực hiện bốn lần pha loãng tuần tự 10 lần độc lập vào những ngày khác nhau, với sáu lần phát hiện lặp lại cho mỗi gradient pha loãng. Tỷ lệ phát hiện dương tính trên 95% có thể được coi là giới hạn phát hiện. Đối với các loại mycoplasma yêu cầu xác nhận giới hạn phát hiện, các nhà sản xuất bộ dụng cụ cần bao phủ càng nhiều loại mycoplasma càng tốt theo yêu cầu của dược điển quản lý và khám phá giới hạn phát hiện cho từng loại mycoplasma. Đối với các công ty dược phẩm sinh học, nên cân nhắc cả các loại mycoplasma ở người.
- Nếu sử dụng hoặc gặp phải tế bào hoặc vật liệu gia cầm trong quá trình sản xuất, cần tiến hành xác minh giới hạn phát hiện đối với Mycoplasma synoviae.
- Nếu sử dụng hoặc gặp phải vật liệu côn trùng hoặc thực vật trong quá trình sản xuất, cần tiến hành xác minh giới hạn phát hiện đối với Acholeplasma.
- Mycoplasma mũi lợn rất phổ biến trong các mẫu bị nhiễm mycoplasma và đã thu hút sự chú ý của Viện Kiểm soát Thực phẩm và Dược phẩm Trung Quốc.
So với Dược điển Châu Âu, Dược điển Nhật Bản không đề cập đến mycoplasma ở gia cầm mà cần phải xác minh giới hạn phát hiện nhưng lại bao gồm mycoplasma trong nước bọt.
Độ bền:
Độ bền vững đề cập đến khả năng của một phương pháp chịu được những thay đổi nhỏ trong điều kiện đo mà không bị ảnh hưởng, cung cấp cơ sở cho việc sử dụng phương pháp đã thiết lập trong thử nghiệm thường quy. Đánh giá độ bền vững nên tập trung vào khả năng chịu đựng của các phương pháp phát hiện mycoplasma đối với những thay đổi về nồng độ MgCl2, mồi và dNTP trong thuốc thử phát hiện, những thay đổi trong bộ dụng cụ chiết xuất axit nucleic hoặc các bước chiết xuất và việc sử dụng các bộ khuếch đại axit nucleic khác nhau.
Nghiên cứu khả năng so sánh
Nếu NAT được sử dụng để thay thế cho các phương pháp dược điển, cần phải xác nhận thông qua so sánh rằng NAT có thể thay thế các phương pháp dựa trên nuôi cấy hoặc phương pháp nuôi cấy tế bào chỉ thị.Điều này thường liên quan đến việc xem xét giới hạn phát hiện của phương pháp, cũng như tính đặc hiệu (chẳng hạn như phạm vi bao phủ mycoplasma và các kết quả dương tính giả có thể xảy ra). Để so sánh giới hạn phát hiện, nó phải đáp ứng các tiêu chí rằng "giới hạn phát hiện là 10 CFU/mL có thể thay thế các phương pháp dựa trên nuôi cấy và giới hạn phát hiện là 100 CFU/mL có thể thay thế các phương pháp nuôi cấy tế bào chỉ thị".
Có hai cách tiếp cận tùy chọn để tiến hành nghiên cứu khả năng so sánh:
- Tiến hành các thí nghiệm đồng bộ sử dụng cùng chủng mycoplasma đã được xác nhận cho cả phương pháp NAT và dược điển để xác nhận giới hạn phát hiện.
- So sánh kết quả xác nhận NAT với kết quả xác nhận phương pháp dược điển trước đây, nhưng cần phải ghi chép cẩn thận các tệp xác nhận cho các tiêu chuẩn mycoplasma được sử dụng trong cả hai phương pháp.
Phát hiện NAT Mycoplasma qPCR - Giải pháp toàn diện
Sản phẩm liên quan
Dịch vụ kỹ thuật
- Cung cấp báo cáo xác thực toàn diện cho Bộ xét nghiệm Mycoplasma qPCR MycAway™.
- Cung cấp dịch vụ kỹ thuật để xác nhận khả năng áp dụng mẫu của khách hàng.
- Cung cấp hỗ trợ kiểm toán.
| Sự miêu tả | Mã số sản phẩm |
| 18461ES | |
| Bộ phát hiện Mycoplasma qPCR MycAway™ (2G) | 40619ES |