Kháng thể chống TaQ polymerase chống TaQ kép để giúp giảm khuếch đại không đặc hiệu

Chẩn đoán phân tử là phân ngành phát triển nhanh nhất trong lĩnh vực IVD. Nó có ưu điểm là thời gian phát hiện ngắn, độ nhạy cao và độ đặc hiệu mạnh. Nó được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán khối u đồng thời và sàng lọc các bệnh truyền nhiễm và bệnh di truyền. Trong lĩnh vực chẩn đoán phân tử, PCR không chỉ là nền tảng công nghệ trưởng thành nhất với thị phần lớn nhất mà còn là công nghệ "tiêu chuẩn vàng" của chẩn đoán lâm sàng. Trong phản ứng PCR truyền thống, vấn đề khuếch đại không đặc hiệu thường xảy ra. Khuếch đại không đặc hiệu ảnh hưởng trực tiếp đến việc giải thích kết quả phát hiện và sẽ dẫn đến giảm độ nhạy khuếch đại và thậm chí là sản lượng các đoạn mục tiêu. Khuếch đại không đặc hiệu xảy ra như thế nào và làm thế nào để có thể tránh hiệu quả?

1. DNA Polymerase thông thường có thể dẫn đến sự khuếch đại không đặc hiệu

2. Hot Start Polymerase có thể cải thiện tính đặc hiệu khuếch đại

3. Kháng thể Taq khối kép có thể cải thiện gấp đôi tính đặc hiệu và độ ổn định của khuếch đại

4. Hiển thị hiệu suất của YeasenTaq khối đôi của 's kháng thể

5. Thông tin sản phẩm

1. DNA Polymerase thông thường có thể dẫn đến sự khuếch đại không đặc hiệu

Tính đặc hiệu trình tự kém của các đoạn mồi là nguyên nhân trực tiếp gây ra sự khuếch đại không đặc hiệu. Là chất xúc tiến của DNA polymerase thông thường, hoạt động exonuclease của nó có thể cắt ngắn trình tự đoạn mồi DNA trong quá trình chuẩn bị hệ thống PCR, để giảm tính đặc hiệu của các đoạn mồi.

Ngoài ra, DNA polymerase thông thường không chỉ có hoạt tính exonuclease mà còn có hoạt tính polymerase. Mặc dù nhiệt độ kéo dài tối ưu của DNA polymerase là 72℃, nhưng polymerase vẫn hoạt động ở nhiệt độ phòng. Do đó, trong quá trình chuẩn bị phản ứng PCR và quá trình gia nhiệt ban đầu, các đoạn mồi có thể hình thành liên kết không đặc hiệu với một số khuôn mẫu sợi đơn và kéo dài dưới tác động của DNA polymerase Taq, dẫn đến khuếch đại các trình tự không phải mục tiêu và ảnh hưởng đến tính đặc hiệu của phản ứng.

Do đó, hệ thống PCR thường được cấu hình trên băng để ức chế hoạt động của DNA polymerase. Mặc dù phương pháp này đơn giản và rẻ tiền, nhưng nó không thể ức chế hoàn toàn hoạt động của enzyme, do đó không thể loại bỏ sự khuếch đại của các sản phẩm không đặc hiệu.

2. Hot Start Polymerase có thể cải thiện tính đặc hiệu khuếch đại

Hot start polymerase là thành phần cốt lõi của hot start PCR. Ở nhiệt độ phòng, vị trí hoạt động của DNA polymerase bị chặn bởi một chất điều chỉnh enzyme. Chỉ sau khi PCR biến tính ở 95℃, chất điều chỉnh enzyme mới giảm xuống và hoạt động của enzyme mới bắt đầu, tránh sự khuếch đại không đặc hiệu do enzyme gây ra.

Hiện nay, các phương pháp biến đổi khởi động nóng thường được sử dụng của DNA polymerase trên thị trường chủ yếu bao gồm phương pháp hóa học, phương pháp phối tử và phương pháp kháng thể. Trong số đó, hiệu ứng chặn của polymerase khởi động nóng được biến đổi bằng kháng thể là tốt nhất và tốc độ giải phóng hoạt động của enzyme nhanh, có thể giảm đáng kể thời gian phản ứng PCR. Đây là phương pháp biến đổi enzyme khởi động nóng được sử dụng rộng rãi trên thị trường IVD.

Tuy nhiên, cần lưu ý rằng phương pháp khởi động nóng kháng thể truyền thống chỉ ngăn chặn hoạt động polymerase 5'→3' của Taq DNA polymerase, chỉ có thể ngăn ngừa sự khuếch đại không đặc hiệu do sự không khớp hoặc sự kết hợp mồi ở nhiệt độ thấp.Tuy nhiên, như đã đề cập ở trên, Taq DNA polymerase không chỉ có hoạt động polymerase 5'→3' mà còn có hoạt động exonuclease 5'→ 3'. Hoạt động exonuclease này có thể dẫn đến sự phân hủy các đầu dò không khớp hoặc các vật liệu khác ở nhiệt độ thấp, dẫn đến một số tín hiệu không đặc hiệu.

3. Kháng thể Taq khối kép có thể cải thiện gấp đôi tính đặc hiệu và độ ổn định của khuếch đại

Là một nhà lãnh đạo sáng tạo trong ngành công nghiệp enzyme phân tử trong nước, Yeasen Công ty TNHH Công nghệ sinh học (Thượng Hải) (sau đây gọi là Yeasen) tập trung vào R & D và sản xuất nguyên liệu enzyme phân tử và dám đổi mới. Dựa vào nền tảng sàng lọc kháng thể trưởng thành của riêng mình, nó sàng lọc kháng thể chặn bằng Taq DNA polymerase làm phân tử mục tiêu. Sau nhiều năm nghiên cứu tỉ mỉ và tối ưu hóa hệ thống, nó đã phát triển kháng thể polymerase DNA kháng Taq khối kép, Nó không chỉ có thể ngăn chặn hoạt động polymerase của Taq DNA polymerase mà còn ngăn chặn hoạt động exonuclease của Taq DNA polymerase. Theo cách tiếp cận hai hướng, nó không chỉ có thể ngăn chặn hiệu quả sự khuếch đại không đặc hiệu do sự không khớp hoặc dimer mồi gây ra mà còn ngăn chặn sự phân hủy vật liệu tạo ra các tín hiệu không đặc hiệu và cải thiện gấp đôi độ ổn định của thuốc thử.

4. Hiển thị hiệu suất của YeasenTaq khối đôi của 's kháng thể

4.1 Việc sử dụng kháng thể Taq khối kép chính xác và nhạy hơn

Sau khi chặn Taq polymerase bằng Yeasenkháng thể khối kép của ' và kháng thể của công ty T, các mẫu dương tính được phát hiện bằng ARMS-PCR.

Hình 1. Đường cong khuếch đại ARMS-PCR; Màu xanh: Kháng thể ngăn chặn của công ty T; Màu đỏ: Yeasenkháng thể khối kép của '

Có thể thấy từ Hình 1 rằng Taq polymerase bị chặn bởi YeasenKháng thể khối kép của 's có kiểu gen chính xác và độ nhạy cao hơn trong khuếch đại ARMS-PCR.

4.2 Kháng thể Taq khối đôi có hiệu quả Chặn hoạt động Exonuclease của Taq DNA Polymerase

Các đầu dò mồi tổng hợp được ghép với dung dịch phản ứng của Taq DNA polymerase bị chặn bởi kháng thể chưa đóng và kháng thể bị chặn kép tương ứng và phản ứng ở 40℃ để phát hiện tín hiệu huỳnh quang của chúng.

Hình 2. Phát hiện hiệu quả chặn của kháng thể chặn kép đối với hoạt động của exonuclease; Màu vàng: nhóm DNA polymerase Taq chưa đóng; Màu tím: Nhóm DNA polymerase Taq bị chặn bởi kháng thể chặn kép

Có thể thấy từ Hình 2 rằng kháng thể chặn kép có thể ngăn chặn hiệu quả hoạt động exonuclease của Taq DNA polymerase.

4.3 Kháng thể Taq khối đôi có thể cải thiện hiệu quả tính ổn định của thuốc thử phát hiện

Taq DNA polymerase đã bị chặn bằng kháng thể chặn truyền thống và kháng thể chặn đôi tương ứng và được định hình thành một premix đầy đủ chứa đầu dò mồi. 10000 bản sao của plasmid ASF đã được khuếch đại ở 4℃ trong 10 ngày hoặc ở 37℃ trong 1, 3 và 5 ngày. Đường cong khuếch đại và các thay đổi giá trị Ct đã được quan sát và các tác động của kháng thể chặn truyền thống và kháng thể chặn đôi đối với độ ổn định của dung dịch phản ứng premix đầy đủ đã được so sánh.

Hình 3.Đường cong khuếch đại của 10.000 bản sao plasmid ASF được khuếch đại bằng kháng thể chặn truyền thống (a) và dung dịch phản ứng chặn kháng thể chặn kép (b); Màu xanh: bảo quản ở nhiệt độ 4℃ trong 10 ngày; Đỏ: đặt ở nhiệt độ 4℃ trong 0 ngày (kiểm soát)

Có thể thấy từ Hình 3 rằng kháng thể chặn đôi có thể duy trì tính ổn định của dung dịch phản ứng và cải thiện hiệu quả tính ổn định của thuốc thử phát hiện so với kháng thể chặn truyền thống. Đường cong khuếch đại và giá trị Ct không thay đổi đáng kể sau khi toàn bộ premix chứa đầu dò mồi bị chặn bởi kháng thể chặn đôi và đặt ở 4℃ trong 10 ngày.

Hình 4. Đường cong khuếch đại của 10.000 bản sao plasmid ASF được khuếch đại bằng kháng thể chặn truyền thống (a) và dung dịch phản ứng chặn kháng thể chặn kép (b); Màu xanh: bảo quản ở nhiệt độ 37℃ trong 5 ngày; Xanh lá cây: 37℃ trong 3 ngày; Vàng: 37℃ trong 1 ngày; Đỏ: đặt ở 37℃ trong 0 ngày (kiểm soát)

Có thể thấy từ Hình 4 rằng kháng thể chặn đôi có thể duy trì tính ổn định của dung dịch phản ứng và cải thiện hiệu quả tính ổn định của thuốc thử phát hiện so với kháng thể chặn truyền thống. Kháng thể chặn đôi chặn toàn bộ premix chứa mồi-dò, và sự khác biệt của giá trị Ct nhỏ hơn 0,2 sau khi được đặt ở 37℃ trong 1, 3 và 5 ngày.

4.4 Kháng thể Taq khối đôi giúp giải quyết vấn đề trôi dạt đường cơ sở

Khi một số mồi kết hợp với đệm và dụng cụ cụ thể, sẽ có sự trôi đường cơ sở. Yeasen đã thử nhiều phương pháp để cải thiện vấn đề cơ bản và nhận thấy rằng kháng thể chặn kép có lợi hơn cho cơ bản ổn định.

Hình 5. Đường cong khuếch đại của gen N (a) và gen ACT (b); Đỏ: kháng thể chặn truyền thống; Xanh lá cây: kháng thể khối kép

Như có thể thấy trong Hình 5, việc sử dụng kháng thể chặn kép dưới các chất đệm và mồi đặc hiệu có thể giúp giải quyết vấn đề trôi đường cơ sở.

4.5 Độ tuyến tính tốt đã đạt được khi sử dụng kháng thể Taq khối đôi

100000, 10000, 1000 và 100 bản sao của plasmid đôi ASF/ACT được khuếch đại bằng dung dịch phản ứng bị chặn bởi kháng thể chặn đôi và đường cong chuẩn được tạo ra.

Hình 6. Đường cong chuẩn của gen ASF (a) và gen ACT (b) được tạo ra bằng dung dịch phản ứng khối kép

Như có thể thấy từ Hình 6, đường cong chuẩn R2 của gen ASF là 0,998 và hiệu suất khuếch đại là 98,848%; Đường cong chuẩn R2 của gen ACT là 0,998 và hiệu suất khuếch đại là 98,113%.

4.6 Taq khối đôi Kháng thể có thể giải phóng nhanh hoạt động của enzyme

Taq polymerase đã bị chặn bởi kháng thể nhập khẩu của công ty T và Yeasenkháng thể khối kép của 's (mã số 31303) tương ứng, và hoạt động của enzyme được phát hiện sau khi sốc nhiệt ở 95℃ trong 20 giây. Có thể thấy rằng 31303 có thể giải phóng hơn 95% hoạt động của enzyme sau khi sốc nhiệt ở 95℃ trong 20 giây, tương đương với kháng thể của công ty T.

Bảng 1. Hoạt động của Enzym

4.7 Taq khối đôi Kháng thể Có thể ngăn chặn nhiều loại Enzym Taq

Ba loại enzyme Taq (loại hoang dã và 2 loại đột biến) đã bị chặn bởi Yeasenkháng thể chặn đôi (mã số cat#31303) và tỷ lệ chặn là 1 μ g: 5 U, đo giá trị huỳnh quang và hiệu quả bịt kín. Có thể thấy rằng hiệu ứng chặn của YeasenKháng thể khối kép (mã số #31303) tốt hơn cho các loại enzyme Taq khác nhau.

Bảng 2. Hiệu quả ngăn chặn của các loại enzyme Taq khác nhau

4.8 Yeasen'S Kháng thể Taq khối đôi không có dư lượng bộ gen ở chuột

Lấy nước làm khuôn mẫu cho đối chứng âm tính và bộ gen chuột làm khuôn mẫu cho đối chứng dương tính, 31303 lô khác nhau đã được khuếch đại. Người ta thấy rằng đoạn mục tiêu không được khuếch đại trong mẫu, cho thấy không có dư lượng bộ gen chuột trong kháng thể.

Hình 7. Sơ đồ phát hiện dư lượng bộ gen chuột

Lưu ý: - là đối chứng âm tính, + là đối chứng dương tính và 1-5 là 31303 mẫu của các lô khác nhau

5. Thông tin sản phẩm