I. Nguyên lý của Western Blot
Western Blot (WB), hay protein immunoblotting, là một kỹ thuật cổ điển để phát hiện các protein cụ thể dựa trên tương tác kháng nguyên-kháng thể, được sử dụng rộng rãi trong sinh học phân tử, miễn dịch học và các lĩnh vực liên quan. Các bước cốt lõi của nó bao gồm:
- Tách protein:
- SDS-PAGE phân tách protein biến tính theo trọng lượng phân tử.
- SDS bao phủ protein bằng một điện tích âm đồng nhất, loại bỏ các ảnh hưởng về mặt cấu trúc.
- Chuyển màng:
- Protein được chuyển từ gel sang màng (ví dụ, PVDF hoặc nitrocellulose).
- Phát hiện kháng thể:
- Kháng thể chính liên kết đặc hiệu với protein mục tiêu, tiếp theo là kháng thể thứ cấp liên hợp với enzyme (ví dụ: HRP) tạo ra tín hiệu có thể phát hiện được, chẳng hạn như phát quang hóa học.
II. Quy trình làm việc Western Blot chuẩn
| Bước chân | Các thủ tục chính | Thuốc thử được đề xuất ( |
| 1. Chuẩn bị mẫu | Chiết xuất protein bằng đệm ly giải RIPA; thêm PMSF để ức chế protease hoạt động. | Dòng đệm ly giải RIPA, PMSF |
| 2. Định lượng Protein | Sử dụng phương pháp BCA (Mã số mèo #20200ES) để định lượng; kết hợp dung dịch pha loãng chuẩn với dung dịch đệm mẫu. | Bộ định lượng BCA (Mã số mèo #20200ES/20201ES) |
| 3. Điện di SDS-PAGE | Sử dụng gel đúc sẵn, chạy ở mức 150 V cho đến khi thuốc nhuộm chạm tới đáy gel. | Gel đúc sẵn, đệm nạp SDS-PAGE |
| 4. Chuyển màng & chặn | Kích hoạt màng PVDF (Mã số mèo #36125ES) bằng cách ngâm trong methanol trong 1 phút; chuyển ở 300 mA trong 60 phút trong bồn nước đá; chặn ở nhiệt độ phòng (RT) trong 1 giờ hoặc sử dụng dung dịch chặn nhanh (Mã số mèo #36122ES) trong 10 phút. | TrĐệm ansfer, Dòng màng PVDF |
| 5. Ủ kháng thể | Ủ với kháng thể chính ở 4°C qua đêm; kháng thể thứ cấp ở nhiệt độ phòng trong 1-2 giờ; rửa kỹ bằng TBST 3 lần. | Chất pha loãng kháng thể |
| 6.Phát hiện protein | Phát triển với ECL (Mã số mèo #36208ES). | Dòng sản phẩm phát quang hóa học ECL |
Hình 1: Quy trình làm việc Western Blot
III. Các vấn đề thường gặp và giải pháp
| Vấn đề | Nguyên nhân có thể | Giải pháp |
| Nền tảng cao  | Chặn không đầy đủ | Sử dụng dung dịch chặn mới và kéo dài thời gian chặn. |
| Rửa không đủ | Tăng tần suất và thời gian rửa để loại bỏ liên kết không đặc hiệu. | |
| Nồng độ kháng thể chính quá mức | Pha loãng kháng thể đến nồng độ thích hợp. | |
| Các vấn đề về chất lượng mẫu | Kiểm tra độ tinh khiết và chất lượng của mẫu; sử dụng mẫu mới. | |
| Sấy màng | Đảm bảo màng luôn đủ nước trong các bước ủ; đảm bảo tiếp xúc hoàn toàn với dung dịch phản ứng. | |
| Tín hiệu yếu hoặc không có  | Chuyển giao không đầy đủ | Kiểm tra hiệu quả truyền tải và điều chỉnh thời gian nếu cần. |
| Màng PVDF chưa hoạt hóa | Ngâm PVDF trong methanol để hoạt hóa trước khi chuyển vào dung dịch đệm. | |
| Sự không phù hợp kháng thể chính với loài mục tiêu | Kiểm tra bảng dữ liệu, so sánh trình tự protein và miễn dịch, và bao gồm kiểm soát dương tính được sử dụng rộng rãi (ví dụ, β-actin trong tế bào động vật có vú). | |
| Không tương thích kháng thể sơ cấp và thứ cấp | Đảm bảo kháng thể thứ cấp phù hợp với loài vật chủ của kháng thể chính. | |
| Liên kết kháng thể không đủ | Tăng nồng độ kháng thể và kéo dài thời gian ủ ở 4°C (ví dụ, qua đêm). | |
| Mức kháng nguyên thấp | Nạp ít nhất 20-30 μg protein cho mỗi làn; sử dụng chất ức chế protease và đối chứng dương tính. | |
| Biểu hiện protein mục tiêu thấp | Xác nhận biểu hiện trong mẫu thông qua tài liệu/cơ sở dữ liệu; tập trung mẫu hoặc sử dụng đối chứng biểu hiện cao. | |
| Các dải không cụ thể/Nhiều dải  | Dòng tế bào bị chuyển qua làm thay đổi cấu hình protein | Sử dụng các tế bào có tần suất chuyển gen thấp (<15 lần chuyển gen) và chạy các đối chứng song song với các tế bào có tần suất chuyển gen sớm. |
| Sự phân hủy protein | Bao gồm chất ức chế protease trong dung dịch đệm ly giải; bảo quản ở nhiệt độ -80°C, tránh đông lạnh-rã đông, sử dụng mẫu tươi. | |
| Sửa đổi sau dịch mã | Kiểm tra tài liệu về các sửa đổi ảnh hưởng đến kích thước dải (ví dụ, ubiquitin hóa, glycosyl hóa). | |
| Nhiều biến thể ghép nối | Xác minh các biến thể mối nối thông qua tài liệu hoặc cơ sở dữ liệu. | |
| Protein dimer/multimer | Thêm β-mercaptoethanol hoặc DTT tươi vào dung dịch đệm tải SDS. | |
| Nhiễm bẩn protein ngoại sinh | Kiểm tra các protein ngoại sinh; thay đổi dòng tế bào nếu cần. | |
| Tải mẫu quá mức | Tối ưu hóa tải lượng (20-30 μg) dựa trên biểu hiện mục tiêu thông qua thử nghiệm gradient. | |
| Sự hình thành đa phân tử | Đun sôi mẫu trong 10 phút để phân tách các đa phân tử | |
| Nồng độ kháng thể chính cao | Giảm nồng độ và/hoặc thời gian ủ để tránh các dải thừa. | |
| Nồng độ kháng thể thứ cấp cao | Nồng độ thấp hơn và bao gồm một biện pháp kiểm soát thứ cấp để giảm sự liên kết không đặc hiệu. | |
| Phát hiện các protein hoặc thành viên họ hàng chưa được báo cáo | Xem lại tài liệu hoặc BLAST; sử dụng các dòng tế bào/mô được khuyến nghị. | |
| Nếu được xác minh, có thể bạn đã phát hiện ra một loại protein mới! | ||
| Vòng tay cười  | Di chuyển nhanh, nhiệt độ bộ đệm cao, quá tải, bộ đệm thấp | Di chuyển chậm, đệm làm mát trước, giảm tải protein, đảm bảo đệm bao phủ hoàn toàn các giếng. |
| Dải cau mày  | Các vấn đề về thiết bị (ví dụ, bong bóng dưới gel) | Điều chỉnh thiết lập để loại bỏ bọt khí và đảm bảo quá trình trùng hợp gel diễn ra đồng đều. |
| Dải đuôi  | Độ hòa tan mẫu kém, phân hủy, đệm tái sử dụng | Trộn đều mẫu, sử dụng mẫu mới, chuẩn bị dung dịch đệm mới. |
| Dây tập hình quả tạ  | Gel không đều trùng hợp, mẫu không tinh khiết | Đúc lại gel để đồng nhất; ly tâm mẫu trước khi sử dụng. |
| Bôi trơn dải  | Tải quá nhiều, chất lượng gel kém | Giảm thể tích mẫu, cải thiện quá trình chuẩn bị gel. |
| Dấu hiệu bong bóng  | Không khí bị kẹt trong quá trình chuyển giao | Loại bỏ bọt khí khi lắp ghép bánh sandwich chuyển. |
| Các đốm đen không đều  | Dung dịch chặn không hòa tan, phân bố kháng thể không đều | Hòa tan hoàn toàn dung dịch chặn, rửa 3 lần bằng TBST, khuấy trong quá trình ủ. |
| Các mảng trắng  | Chất nền làm giảm nồng độ kháng thể cao | Giảm nồng độ kháng thể sơ cấp/thứ cấp. |
Ⅳ.Công cụ lựa chọn và tối ưu hóa sản phẩm
Sản phẩm liên quan:
| Thủ tục | Mèo số. | Tên sản phẩm | Thông số kỹ thuật |
| Chuẩn bị mẫu | 20101ES | Đệm ly giải RIPA (mạnh) | 100mL |
| 20115ES | Đệm ly giải RIPA (trung bình) | 100mL | |
| 20114ES | Đệm ly giải RIPA (Yếu) | 100mL | |
| 20118ES | Đệm ly giải cho xét nghiệm WB/IP | 100mL | |
| Bộ định lượng protein BCA (nâng cao) | 500 tấn/2500 tấn/5000 tấn | ||
| Bộ định lượng protein BCA (Sẵn sàng sử dụng) | 500 tấn | ||
| Điện di SDS-PAGE | Chỉ thị protein Gold Band Plus 3 màu thông thường (8-180 kDa) | 250 μL/2×250 μL/10×250 μL | |
| Đánh dấu protein phạm vi cao 3 màu GoldBand™ (10-245 KDa) | 2×250 μL/10×250 μL | ||
| 20328ES | Bộ dụng cụ chuẩn bị gel SDS-PAGE | 1 bộ (30~50 gel)/ 1 bộ (150~250 gel) | |
| Bộ dụng cụ chuẩn bị nhanh PAGE Gel | Nồng độ: 8%, 10%, 12,5%, 15% | ||
| 36259ES-36280ES | Gel Protein Plus đúc sẵn | Nồng độ: 8%、10%、12%、4-12%、4-20% Tùy chọn tải giếng: 10 giếng, 12 giếng, 15 giếng | |
|
Chuyển màng & Chặn | Màng PVDF 0,45 μm (1 cuộn, 30cm×3 m) | 1 cuộn | |
| Màng PVDF 0,22 μm (1 cuộn, 30cm×3 m) | 1 cuộn | ||
| Ủ kháng thể | 36206ES | Dung dịch pha loãng kháng thể chính và phụ cho WB | 100mL/500mL |
|
Phát hiện protein | Thuốc thử phát hiện Super ECL | 100mL/500mL | |
| Bộ chất nền phát quang hóa học ECL nâng cao | 100mL/500mL |
V.Làm thế nào để nhận được hỗ trợ
Để khắc phục sự cố được cá nhân hóa hoặc tối ưu hóa giao thức:
- Thăm nom:
Yeasen Trang sản phẩm Western Blot - E-mail: info@yeasenbio.com
Nguyên tắc vàng để thành công: Quy trình chuẩn hóa + thuốc thử chất lượng cao + xác nhận từng bước = kết quả WB có thể tái tạo!
