细胞凋亡一般是指细胞在发育过程中或在某些因素作用下，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡。细胞凋亡在胚胎发育和形态发生、组织中正常细胞群的稳定性、机体的防御和免疫反应、疾病或中毒引起的细胞损伤和衰老以及肿瘤的发生发展中起着重要作用，并具有潜在的治疗意义。

凋亡途径中各事件的发生具有一定的时间顺序，即事件按先后顺序发生，最终导致凋亡小体的出现，伴随细胞凋亡的发生。

其典型特征如下：

1. 早期细胞凋亡：细胞膜结构改变、磷脂酰丝氨酸外翻；

2. 早中期细胞凋亡：胞浆密度增高，线粒体膜电位消失，通透性发生改变，细胞色素C释放到胞浆中；

3. 晚期凋亡：凋亡信号转导；

4. 晚期细胞凋亡：DNA降解为180~200bp片段大小。

图 1：凋亡途径中连续事件的发生和检测

1. 早期细胞凋亡：Annexin-V/PI 双重染色（检测细胞外膜上的 PS）

在正常活细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）位于细胞膜内侧。当发生细胞凋亡时，细胞膜发生变化，PS由细胞膜内表面翻转到细胞膜外表面。Annexin-V是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，分子量为35-36KD，能与PS以较高的亲和力结合。利用荧光素（FITC、Alexa fluor488等）标记的Annexin-V作为探针，可通过流式细胞术或荧光显微镜识别凋亡细胞和活细胞。

坏死细胞的PS也会从细胞膜内表面翻到细胞膜外表面，Annexin-V也能识别坏死细胞表面的PS，因此Annexin-V无法区分坏死细胞和凋亡细胞。另外，碘化丙啶（PI）是一种核酸染料，可以与细胞内的DNA结合，不能穿透完整的细胞膜。早期凋亡细胞和活细胞的细胞膜尚完整，PI染料不能自由透过细胞膜进入细胞内与DNA结合，因此PI染料无法标记凋亡细胞和活细胞，但PI染料可以透过坏死细胞的细胞膜与细胞内的DNA结合。死细胞中的PI染料在受到488nm激光激发后会发出红色荧光，并被相应通道接收。因此Annexin V与PI配合使用可以区分活细胞、早期凋亡细胞和坏死细胞。

图2：annexin-v/pi双染后流式细胞结果分析

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2. 早期细胞凋亡：JC-1染色（检测线粒体膜电位变化）

细胞凋亡过程中常常伴随线粒体跨膜电位的破坏，这被广泛认为是细胞凋亡级联过程中最早发生的事件之一，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体跨膜电位崩溃，细胞凋亡是不可逆的。线粒体跨膜电位的存在使得一些亲脂性阳离子荧光染料如罗丹明123、JC-1、JC-10等能够与线粒体基质结合，它们的荧光的增多或减少表明了线粒体内膜电负性的增加或减少。

JC-1被广泛应用于检测线粒体膜电位△ΨM，显示线粒体中电位依赖性的积累。 在正常线粒体中，JC-1在线粒体基质中聚集形成聚合物，发出强红色荧光（ex=585nm，em=590nm）； 在凋亡细胞中，线粒体跨膜电位去极化，JC-1从线粒体中释放出来，浓度降低，并逆转为发出绿色荧光的单体形式。 因此颜色的变化直接反映了线粒体膜电位的变化。 线粒体去极化的程度也可以通过红/绿荧光强度的比率来测量。 JC-1检测是一种常见的方法。

3. 晚期细胞凋亡：TUNEL法（DNA片段原位标记法）

在细胞凋亡的晚期，由于染色体DNA双链断裂或单链断裂，产生大量黏性的3-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）作用下，荧光素酶标记的dUTP可结合到DNA的3末端，从而可以检测到凋亡细胞，此种方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）。由于正常或增殖细胞几乎没有DNA断裂，也就没有3-OH形成，极少能被染色。TUNEL其实是一种分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，可以准确反映细胞凋亡的典型生化和形态学特征。它可以用来测定石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养细胞及从组织分离的细胞的形态，并能检测到极少量的凋亡细胞，因此在细胞凋亡的研究中得到广泛的应用。

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