細胞凋亡（apoptosis）一般是指細胞在發育過程中或在某些因素的作用下，透過細胞內基因及其產物的調控而發生的一種程序性細胞死亡。細胞凋亡在胚胎發育和形態發生、組織中正常細胞群的穩定性、機體的防禦和免疫反應、疾病或中毒引起的細胞損傷和衰老以及腫瘤的發生和發展中起重要作用，並具有潛在的治療意義。

凋亡途徑中各事件的發生具有一定的時間順序，即事件依先後順序發生，最終導致凋亡小體的出現，伴隨細胞凋亡的發生。

其典型特徵如下：

1. 早期細胞凋亡：細胞膜結構改變、磷脂醯絲胺酸外翻；

2. 早期細胞凋亡：胞漿密度增高，粒線體膜電位消失，通透性改變，細胞色素C釋放到胞漿中；

3. 晚期凋亡：凋亡訊號傳導；

4. 晚期細胞凋亡：DNA降解為180~200bp片段大小。

圖 1：凋亡途徑中連續事件的發生與偵測

1. 早期細胞凋亡：Annexin-V/PI 雙重染色（檢測細胞外膜上的 PS）

在正常活細胞中，磷脂醯絲胺酸（PS）位於細胞膜內側。當細胞凋亡時，細胞膜改變，PS由細胞膜內表面翻轉到細胞膜外表面。 Annexin-V是一種Ca2+依賴性的磷脂結合蛋白，分子量為35-36KD，能與PS高親和力結合。使用螢光素（FITC、Alexa fluor488等）標記的Annexin-V作為探針，可以透過流式細胞儀或螢光顯微鏡識別凋亡細胞和活細胞。

壞死細胞的PS也會由細胞膜內表面翻轉到細胞膜外表面。 Annexin-V也能辨識壞死細胞表面的PS，因此Annexin-V無法區分壞死細胞和凋亡細胞。此外，碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，可以與細胞內的DNA結合，但不能穿透完整的細胞膜。早期凋亡細胞及活細胞的細胞膜尚完整，PI染料不能自由透過細胞膜進入細胞內與DNA結合，所以PI染料不能標記凋亡細胞和活細胞，但PI染料可以透過壞死細胞的細胞膜與細胞內的DNA結合。死細胞中的PI染料受到488nm雷射激發後會發出紅色螢光，並被對應通道接收。因此Annexin V與PI可以合併使用來區分活細胞、早期凋亡細胞和壞死細胞。

圖2：annexin-v/pi雙染後流式細胞結果分析

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2. 早期細胞凋亡：JC-1染色（檢測粒線體膜電位變化）

細胞凋亡過程常伴隨粒線體跨膜電位的破壞，被廣泛認為是細胞凋亡級聯過程中最早發生的事件之一。它發生在核凋亡特徵（染色質濃縮、DNA斷裂）出現之前。一旦粒線體跨膜電位崩潰，細胞凋亡是不可逆的。粒線體跨膜電位的存在使得一些親脂性陽離子螢光染料如羅丹明123，JC-1，JC-10等能夠與粒線體基質結合。其螢光的增強或減弱表示粒線體內膜電負性的增強或減弱。

JC-1被廣泛應用於檢測粒線體膜電位△ΨM，顯示粒線體中電位依賴性的累積。 在正常粒線體中，JC-1在粒線體基質中聚集形成聚合物，發出強紅色螢光（ex=585nm，em=590nm）； 在細胞凋亡時，粒線體跨膜電位去極化，JC-1從粒線體釋放出來，濃度降低，並逆轉為單體形式發出綠色螢光。 因此顏色的變化直接反映了粒線體膜電位的變化。 粒線體去極化的程度也可以透過紅/綠螢光強度的比率來測量。 JC-1檢測是一種常見的方法。

3. 晚期細胞凋亡：TUNEL法（DNA片段原位標記法）

細胞凋亡後期，由於染色體DNA雙股斷裂或單股斷裂，產生大量黏性3-OH末端。在去氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)作用下，螢光素酶標記的dUTP可以結合到DNA的3端，因此可以檢測到凋亡細胞，此種方法稱為脫氧核苷酸末端轉移酶介導的dUTP缺口末端標記法(TUNEL)。由於正常細胞或增殖細胞幾乎沒有 DNA 斷裂，因此不會形成 3-OH，也很少有細胞能被染色。 TUNEL其實是一種分子生物學與形態學結合的研究方法。原位染色檢測單一完整的凋亡細胞核或凋亡小體，可以準確反映細胞凋亡的典型生化和形態學特徵。它可以用來測定石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養細胞及從組織分離的細胞的形態，並能檢測到極少量的凋亡細胞，因此在細胞凋亡的研究中得到廣泛的應用。

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