T7高產量RNA合成試劑盒促進了不同長度不同的轉錄本的有效合成

這 d描述 T7 高產量 RNA 合成試劑盒

T7高產量RNA合成試劑盒優化了轉錄反應體系。該試劑盒利用T7 RNA聚合酶，高效合成單股RNA， 公升以T7啟動子序列為模板，線性化雙股DNA為模板，以NTPs為受質，轉錄啟動子下游的DNA序列。在轉錄過程中，修飾的核苷酸可以 也 作為底物添加以產生生物素或染料標記的RNA。

該試劑盒可以合成 兩個都 長轉錄本和短轉錄本，每輸入1 μg DNA模板即可產生100-200 μg RNA。轉錄合成的RNA可用於各種下游應用，例如RNA結構和功能研究時長es、RNase保護、探針雜交、RNAi、顯微注射和體外翻譯。

合成原理

圖1：體外RNA轉錄過程

產品優勢

高產： 透過轉錄反應，2小時內可生產高達200 μg

更好的多功能性： 適用於20nt-10000nt RNA的轉錄

優異的性能： 有效減少IVT過程中轉錄的副產物

多種應用： 可用於普通、標記和修飾的RNA合成

產品特性

圖 2：不同長度的轉錄本產量

圖 3：不同長度的轉錄本的質量

圖4： 表達 謄寫 信差核糖核酸 在 HEK-293 細胞

註：mRNA已用痘苗加帽酶加帽（Yeasen#10614/10615）。

實驗方法

解凍試劑

    將 T7 RNA 聚合酶混合物短暫離心，然後放置 它 在冰上。解凍10×轉錄緩衝液和核苷酸s （ATP、CTP、GTP、UTP），混勻離心至管底，將10×Transcription Buffer放置室溫，將4種核苷酸放置冰上。

    B.室溫下組裝轉錄反應

      依照下列體系製備反應體系：

      成分

      容量 (µL)

      最終濃度

      無 RNase H2哦

      最多 20

      -

      10×轉錄緩衝液

      2

      1×

      CTP / GTP / ATP / UTP (各 100 mM)

      各 2 個

      每個 10 毫米

      模板DNA

      1 微克

      -

      T7 RNA 聚合酶混合物

      2

      -

      筆記：

      1. 此反應在室溫下進行。由於10×Transcription Buffer中含有亞精胺，低溫下亞精胺濃度過高可能造成DNA模板沉澱。
        對於短轉錄本（<100 nt），可以使用2 µg 模板，轉錄時間延長至 4-8 小時。
        3. 對於長轉錄物（>1000nt），建議使用線性化質粒作為轉錄模板。
        4. 在PCR儀上進行反應時，請打開熱蓋，以防止蒸發。
        5.反應產物可能有白色沉澱。此沉澱物是焦磷酸鎂，由 反應溶液中存在遊離的焦磷酸根離子和鎂離子，不影響後續實驗。如果你想去除它，可以添加一些 EDTA。如果加入EDTA影響後續實驗，也可以透過離心回收上清液。
        6.保持試劑和容器不受RNase污染。
      C.37°C孵育2小時

      混合成分溶液，短暫離心至管底，在 37°C 下孵育 2 小時。如果轉錄本長度小於100 nt，則將反應時間延長至4-8小時。

      D.DNase I 處理（可選）

      反應完成後，每管加入2 μL DNase I（無RNase），37°C 孵育15分鐘，以去除模板DNA。

      常見問題

      1. 轉錄產量低

      模板的品質與產量密切相關。實驗組產量明顯低於對照組。可能的原因有：

      • 實驗模板中含有抑製成分；
      • 模板可能有問題。

      建議：①重新純化模板； ②確定模板定量及其完整性； ③延長反應時間； ④ 增加範本輸入量； ⑤ 利用其他推廣者 其他 RNA 聚合酶。

      1. 短轉錄本產量低

      短的模板片段會抑制反應。當轉錄產物少於100nt時，若想增加產量，可延長反應時間為4-8h或增加模板用量至2μg。

      1. RNA轉錄長度為 更大 比預期的

      若電泳結果顯示產物條帶大於預期的大小，可能的原因是： ①質粒模板沒有完全線性化； ②正義鏈3’端具有突出的結構； ③RNA具有未完全變性的二級結構。

      建議：①檢查模板是否完全線性化，必要時進行額外線性化； ②選擇適當的限制性內切酶，避免3’突出，或使用Klenow Fragment/T4 DNA聚合酶完成轉錄後再進行下一步； ③用變性凝膠檢測RNA產物。

      1. RNA轉錄長度為 更小 比預期的

      如果電泳結果顯示產物條帶小於預期大小，可能的原因 是：①模板含有與T7 RNA聚合酶終止子類似的終止序列； ②GC含量 模板太高。

      建議： ①降低反應溫度（例如30℃）。有時降低溫度有助於延長轉錄長度，但也可能 降低產量。嘗試其他 用於轉錄的 RNA 聚合酶； ②若模板GC含量較高，可將反應溫度設為42℃，或加入SSB以提高產量及轉錄長度。

      1. 轉錄產物電泳拖尾

      電泳過程中出現拖尾現象可能的原因有： ① 實驗操作過程中RNase污染； ②DNA模板被RNases污染。

      建議： ①使用無RNase的槍頭和EP管，戴上一次性乳膠手套及口罩，所有試劑皆使用無RNase的H2O.②重新純化模板DNA。

      訂購資訊

      產品名稱

      目錄編號

      年代規格

      T7 高產量 RNA 合成試劑盒

      10623ES

      50/100/500 噸

      T7 RNA 聚合酶 GMP 級（250 U/μL）

      10625ES

      10千單位/100千單位/2500千單位/25萬單位

      焦磷酸酶，無機 GMP 級 (1 U/μL)

      10620ES

      10U/100U/1000U

      小鼠 RNase 抑制劑 GMP 級 (40 U/μL)

      10621ES

      10千單位/20千單位/100千單位/100萬單位

      mRNA痘苗加帽酶GMP級

      10614ES

      2KU/10KU/100KU

      mRNA Cap 2'-O-甲基轉移酶 GMP 級

      10612ES

      10千單位/50千單位/250千單位

      去氧核糖核酸酶 I (DNase I) GMP 級

      10611ES

      500/2000/10000 美國

      Hieff NGS® mRNA 分離主試劑盒

      12603ES

      24/96 噸

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