Mycoplasma, også kendt som pleuropneumoni-lignende organismer (PPLO), er de mindste og enkleste prokaryoter, der er opdaget hidtil, og som mangler en cellevæg. De har en diameter på 0,1 til 0,3 μm, kan passere gennem filtre og udviser høj pleomorfisme. De er relativt almindelige og vanskelige at påvise bakterielle kontaminanter i pattedyrcellekulturer
Mycoplasma-kontamination har flere negative virkninger på cellekulturer og er blevet et alvorligt problem i cellekulturpraksis. Det anslås konservativt, at mycoplasma-kontaminationsraten i rutinecellekulturer varierer fra 15 % til 35 %, hvilket alvorligt forstyrrer troværdigheden af de eksperimentelle resultater.
Cirka 95 % af mycoplasma-kontaminationen i cellekulturer er primært forårsaget af Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma arginini, Mycoplasma orale, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma hominis og Mycoplasma hyorhinis. På dyrkningsmedier danner mycoplasmakolonier et "stegt æg"-udseende. Cellekultursupernatanter og cellemembraner giver et egnet miljø for mycoplasma-vækst, og mycoplasma, der parasiterer overfladen af celler, kan trænge ind i værtscellemembranen.
De vigtigste kilder til mycoplasma-kontamination omfatter: cellekulturmedier eller dets komponenter (såsom råmaterialer til mediet, serum og andre reagenser), laboratoriepersonale, cellekulturinkubatorer, opbevaringstanke til flydende nitrogen, luftbårne partikler og aerosoler, overforbrug af antibiotika, ukorrekt forseglede cellekulturer og celler, der allerede er kontaminerede med mycoplasma.
I mellemtiden omfatter de tilsvarende farer ved disse kontamineringer: fører til batch-skrotning af celleprodukter eller produkter fremstillet ved brug af celler som et medium på grund af manglende evne til effektivt at fjerne mycoplasma under nedstrøms oprensning; kontaminering af alt relateret udstyr og faciliteter, såvel som mellemprodukter eller slutprodukter, der kommer i kontakt med det forurenede materiale; forårsager, at andre normale celler bliver kontamineret med mycoplasma; resulterer i skrotning af vigtige celle- eller virale frøbanker på grund af mycoplasma-kontamination; at tvinge laboratoriet til at standse produktionen eller eksperimentelle operationer for at håndtere mycoplasma-kontaminationen; fører til udvikling af mycoplasma-resistens, hvilket gør det endnu sværere at eliminere; udvidelse af området for mycoplasma-kontamination; og udgør en trussel mod andre cellekulturer i laboratoriet.
Derfor skal der udføres regelmæssig mycoplasma-testning og -fjernelse for at sikre, at der ikke er mycoplasma til stede i cellekultursystemet, hvilket er afgørende for den normale videnskabelige forskning.
Mycoplasma Opdagelse
Mycoplasma er en relativt almindelig, men typisk svær at fjerne type forurening. For biologiske processer, der involverer cellekultur, kræver reglerne, at 'der ikke må være mycoplasma-kontamination.'
- 2020-udgaven af den kinesiske farmakopé, bind III, 'Forberedelse og kvalitetskontrol af animalske cellesubstrater til produktion og afprøvning af biologiske produkter', bestemmer, at for celler, der anvendes i produktionen, skal mycoplasmatestning udføres på Master Cell Bank (MCB), Working Cell Bank (WCB) og End-of-Production Cells (EOPC).
- FDA, Vejledning for industrien: Karakterisering og kvalificering af cellesubstrater og andre biologiske materialer, der anvendes til fremstilling af virale vacciner til indikationer af infektionssygdomme, foreskriver, at mycoplasmakontrol skal udføres på råmaterialer, virusfrø, uforarbejdede høstvæsker og andre sådanne materialer.
- ICH Q5D, 'Udledning og karakterisering af cellesubstrater brugt til produktion af bioteknologiske/biologiske produkter', nævner også, at mycoplasmakontrol skal udføres på råmaterialer, virusfrø, uforarbejdede høstvæsker og andre sådanne materialer.
Figur 1 Mycoplasma-kontaminationstestpunkter krævet af nationale og internationale regler
Traditionelle mycoplasma-detektionsmetoder omfatter hovedsageligt dyrkningsmetoder og indikatorcellemetoder. Men på grund af de lange detektionscyklusser eller følsomhedsproblemer ved disse to metoder, fører de til udvidede produktions- eller produktudgivelsescyklusser for virksomheder. Med udviklingen af celle- og genterapi er industriens krav til aktualitet og følsomhed af mycoplasma-detektion blevet stadig strengere. Korte holdbarhedstider er utilstrækkelige til at understøtte så lange detektionsperioder, hvorfor den hurtige NAT-metode (Nucleic Acid Testing) har skilt sig ud blandt forskellige mycoplasma-detektionsmetoder.
Figur 2 Mycoplasma-detektionsmetoder opført i nationale og internationale regler
Baseret på NAT (nukleinsyreamplifikationsteknikker) har Yeasen udviklet en række hurtige mycoplasma-detektionskit, herunder Mycoplasma Real-time qPCR Detection Kit, MycAway™ Plus-Color One-Step Mycoplasma Detection Kit og GMyc-PCR Mycoplasma Test Kit.
1.Mycoplasma Real-time qPCR Detection KitDet er et produkt til hurtig kvalitativ påvisning af potentiel mycoplasma-kontamination i produktionsråmaterialer, cellebanker, virale frø, virale eller cellehøstvæsker og terapeutiske celler. Det bruges primært i forskning, udvikling, produktion og frigivelsesprocesser af biofarmaceutiske produkter.
Produktkvalifikationer
Regulativ overholdelse: Valideret i henhold til kravene i EP2.6.7, JP G3 og USP 63 farmakopéer, der opfylder standarderne for internationale autoritative organisationer.
Overholdelse af revision: Produktproduktionen overholder ISO13485 kvalitetsstyringssystemstandarderne og understøttes af omfattende revisionsdokumentation.
Kvalitetssikring: Alle enzymråmaterialer, der kræves til kittet, er selvproducerede og er blevet industrialiseret, hvilket sikrer stabil forsyning.
Opbygning af teknisk erfaring: Der er et solidt teknisk fundament i TaqMan-metoden, og kitsens følsomhed kan nå op på 10 CFU/mL og derunder.
Fokus på produktydelse: Taq enzymantistofbiblioteket med dobbeltblokerende antistoffer øger sættets specificitet, følsomhed og stabilitet.
Produktegenskaber
Flere registreringstyper: Optimerede TaqMan-prober kan detektere op til 183 mycoplasmaarter.
Nem at bruge: Den samlede tid til prøveforberedelse og testning er mindre end 3 timer, hvilket eliminerer behovet for en 28-dages ventetid forbundet med dyrkningsmetoder.
Høj følsomhed: Detektionsgrænsen er så lav som 10 CFU/mL, hvilket gør det til et levedygtigt alternativ til direkte dyrkningsmetoder.
Høj specificitet: Primere og prober er designet målrettet mod 16S rRNA, hvilket sikrer ingen krydsreaktion med nært beslægtede arter såsom clostridier og lactobaciller.
Høj sikkerhed: Den positive kontrol (PC) i sættet er ikke-infektiøs, hvilket helt eliminerer risikoen for kontaminering.
Stærk interferensmodstand: Indførelsen af en intern kontrol (IC) hjælper med at udelukke prøveinterferens og abnormiteter i reaktionsforberedelsen, hvilket effektivt undgår falske negativer.
Figur 3 Arbejdsgang for Mycoplasma-detektion ved hjælp af Mycoplasma Real-time qPCR-detektionskit
2.MycAway™ Plus-Color One-Step Mycoplasma Detection KitDen anvender en unik isotermisk forstærkningsteknologi, der tilbyder højere farvediskrimination. Ændringen fra blåviolet (negativ) til himmelblå (positiv) er lettere at se med det blotte øje. Derudover indeholder det anti-kontamineringskomponenter for at eliminere forekomsten af falske positiver.
Figur 4: Betjeningsprocedure for Mycoplasma-detektion ved hjælp af MycAway™ Plus-Color One-Step Mycoplasma Detection Kit
3.GMyc-PCR Mycoplasma OpdagelseKitI modsætning til konventionelle et-trins PCR-detektionsmetoder øges antallet af primere fra et par til tre par, der målretter mod de konserverede områder af mycoplasma 16S og 23S rRNA til indlejret PCR-amplifikation. Dette reducerer ikke kun uspecifikke produkter, men øger også produktets følsomhed betydeligt, hvilket muliggør påvisning af så få som en enkelt kopi af mycoplasma.
、
Figur 5 Driftsprocedure for Mycoplasma-detektion ved hjælp af GMyc-PCR Mycoplasma-testkit
Mycoplasma fjernelse
I processen med cellekultur kan regelmæssig test effektivt forhindre storskala mycoplasma-kontamination. Men hvis cellerne allerede er forurenet med mycoplasma, skal de håndteres omgående. Den bedste praksis er at sterilisere de forurenede celler under højt tryk og derefter kassere dem for at undgå at forurene andre rene cellelinjer. Hvis de forurenede celler er særligt værdifulde, og det er nødvendigt at fjerne mycoplasma-forureningen, kan en kombination af antibiotika bruges til at nå dette mål. Da mycoplasmas mangler en cellevæg, er traditionelle antibiotika generelt ineffektive mod dem. Derfor er det afgørende at vælge et passende mycoplasma-fjernelsesreagens.
Yeasens MycAway™ Treatment (1000×) er et blandet antibiotisk præparat, der indeholder tre komponenter med antimikrobielle virkninger på mycoplasma: quinoloner, tetracyclinderivater og makrolidantibiotika. Dette mycoplasma-fjernelsesreagens opnår effektiv mycoplasma-clearance ved at hæmme DNA-syntese og produktionen af proteiner, der er essentielle for mycoplasma-vækst, uden at skade cellerne. Det maksimerer cellebjærgning og minimerer tab på grund af mycoplasma-kontamination.
Produktegenskaber
Lav toksicitet: Minimal toksicitet for celler, der sikrer ingen interferens med efterfølgende celleeksperimenter såsom transfektion og levedygtighedsanalyser.
Høj stabilitet: Reagenset kan opbevares i lang tid ved -20°C og bevarer sin høje effektivitet.
Nem at bruge: Tilsæt blot produktet til det mycoplasma-kontaminerede dyrkningsmedium og inkuber.
Hurtigt virkende: 'Øjeblikkelige resultater' med virkninger synlige så hurtigt som inden for 3 dage.
Bredt spektrum: I stand til at fjerne størstedelen af mycoplasmatyper fundet i laboratorier.
Figur 6.Illustration af Mycoplasma Removal Reagent Cytotoxicity Test
Forebyggelse af mycoplasma
I processen med cellekultur forekommer ofte mycoplasma-kontamination. Men på grund af dets unikke egenskaber er det svært at opdage med det blotte øje eller mikroskopisk udstyr. Derfor er det særligt vigtigt at gøre et godt stykke arbejde med at forebygge mycoplasma. Effektiv forebyggelse af mycoplasma-kontamination kan opnås ved at tilsætte mycoplasma-forebyggende reagenser til dyrkningsmediet.
På nuværende tidspunkt stammer mycoplasma i laboratorier hovedsageligt fra: krydskontaminering mellem celler, kontaminering af arbejdsmiljøet eller laboratorieudstyr, dårlige aseptiske teknikker fra forsøgsledere, kontaminerede dyrkningsmedier eller reagenser og originale væv eller organer med mycoplasma-kontamination. Den mycoplasma forebyggende produktserie udviklet af Yeasen har enkelhed, bekvemmelighed og høj stabilitet, hvilket gør den meget velegnet til mycoplasma forebyggelse i rutinemæssige cellelinjekulturer.
Produktinformation
| Produkt | Katalognummer | Produktnavn | produktspecifikation |
| Prøve forbehandlingssæt | 18461ES | 25T/100T | |
| 18467ES | MolPure® Mag48 prøveforberedelseskit FN | 3×16T/ 6×16T | |
| Nukleinsyreekstraktionsinstrument | 80511ES | 48-kanals automatiseret nukleinsyreekstraktor | 48 kanal |
|
Mycoplasma Detection Kit | 40619ES | MycAway® Mycoplasma qPCR-detektionssæt i realtid (2G)
| 25T/100T |
| 40612ES | 25T/100T | ||
| 40601ES | 10 analyser/20 analyser | ||
| Reagens til fjernelse af mycoplasma | 40607ES | 1mL/5×1mL
| |
|
Mycoplasma forebyggelsesreagens | 40608ES | MycAwayTM Profylaktisk (2000×) -Mycoplasma forebyggelsesreagens | 1mL/5×1mL
|
| 40605ES | MycAwayTM Spray (klar til brug) | 500mL/2×500mL/10×500mL
| |
| 40609ES | MycGuardTM-1 opløsning (100×), til desinficering af vandbad i CO2-inkubator | 100 ml | |
| 40610ES | MycGuardTM-2 Opløsning (500×), til desinficering af almindeligt vandbad | 100 ml |