Introduktion til apoptose
Apoptose er et programmeret celledødsfænomen, der opstår under udviklingen af en celle, eller når den påvirkes af visse faktorer, og udløses af reguleringen af intracellulære gener og deres produkter. I apoptosevejen forekommer begivenheder i en kronologisk rækkefølge, én efter én, hvilket fører til præsentationen af apoptotiske vesikler, og derefter opstår apoptose. Apoptose spiller en afgørende rolle i embryonal udvikling og morfogenese, opretholdelsen af en stabil population af normale celler i væv, kroppens forsvar og immunresponser, cellulær skade forårsaget af sygdom eller forgiftning, aldring og udvikling af tumorer, og har potentiel terapeutisk værdi.
Detektionsprincip
Fordelingen af fosfolipider i normale cellemembraner er asymmetrisk. phosphatidylserin (PS) er placeret på den indre overflade af cellemembranen i levende celler, og under apoptose undergår cellemembranen en forandring, og PS vendes fra den indre overflade af cellemembranen til den ydre overflade af cellemembranen. Annexin V genkender specifikt PS på overfladen af apoptotiske celler, hvorimod PS fra levende celler er placeret på den indre overflade af cellemembranen og ikke er i stand til at binde specifikt til Annexin V.
PS af nekrotiske celler vender også fra den indre overflade af cellemembranen til den ydre overflade af cellemembranen, og Annexin V genkender også PS på overfladen af nekrotiske celler, så Annexin V er ikke i stand til at skelne mellem nekrotiske og apoptotiske celler. I modsætning hertil var PI farvestof i stand til at binde til intracellulært DNA og skelne mellem nekrotiske celler og levende celler. Cellemembranen i tidlige apoptotiske celler og levende celler er stadig intakt, og PI-farve kan ikke frit passere gennem cellemembranen for at komme ind i cellen og binde sig til DNA'et, så PI-farve kan ikke mærke apoptotiske celler og levende celler, mens PI-farve er i stand til at passere gennem cellemembranen i de nekrotiske celler og binde sig til PI-cellen inde i cellen og viljen. udsender rød fluorescens efter at være blevet exciteret af 488 nm laseren, som vil blive modtaget af den tilsvarende kanal. Så Annexin V og PI kan bruges samtidigt til at skelne mellem levende celler, tidlige apoptotiske celler og sene apoptotiske eller nekrotiske celler.
Fig. 2 Princip for Annexin V/PI-detektion
Flowcytometridetektion
Den maksimale excitationsbølgelængde for FITC er 488 nm, den maksimale emissionsbølgelængde er 525 nm, og den grønne fluorescens af FITC detekteres i FL1-kanalen. Den maksimale excitationsbølgelængde af PI-DNA-kompleks er 535 nm, den maksimale emissionsbølgelængde er 615 nm, og den røde fluorescens af PI detekteres i FL2- eller FL3-kanalen. Analysen blev udført med software såsom CellQuest, og et to-farvet scatter plot blev tegnet med FITC som den horisontale koordinat og PI som den vertikale koordinat. I typiske eksperimenter kan cellerne opdeles i tre subpopulationer, hvor levende celler kun har meget lav intensitet baggrundsfluorescens, tidlige apoptotiske celler kun har stærk grøn fluorescens, og sene apoptotiske celler har dobbeltfarvning med grøn og rød fluorescens.
Fig.3 Flowcytometridetektion
Ofte stillede spørgsmål
Spørgsmål: Kan Annexin V apoptoseanalysen anvendes på planter eller bakterier (prokaryoter)?
A: Ja, men det er nødvendigt at fremstille protoplaster, fordi planteceller eller bakterier (prokaryoter) indeholder cellevægge. Den specifikke dosering af farveopløsning behøver kun at nedsænke cellerne, og farvningstiden er noget forskellig for forskellige celler.
Q: Hvordan bedømmer man resultatet af eksperimentet?
A: Levende celler (Annexin V-/PI-), tidlige apoptotiske celler (Annexin V+/PI-), sene apoptotiske celler og nekrotiske celler viser dobbelt positivitet (Annexin V+/PI+), nøgne kerner (Annexin V-/PI+).
Q: Hvad er forskellen mellem Annexin V og TUNEL?
A: Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end-mærkning (TUNEL) er en farvningsmetode, der bruges til at identificere intracellulære DNA-fragmenteringssteder - et kendetegn ved sen apoptose.
Annexin V-farvning genkender de tidlige stadier af apoptose ved at binde til PS-rester eksponeret uden for cellen på grund af tab af cellemembranasymmetri.
Spørgsmål: Er det muligt at udføre analysen udelukkende ved brug af Annexin V-FITC uden at detektere PI?
A: Ja, det er muligt. For specielle testprøver, såsom røde blodlegemer uden kerner, eller brugen af lægemidlet Doxorubicin (Adriamycin), som interfererer med PI-detektion, er det muligt at udføre analysen ved kun at bruge Annexin V-FITC i begge tilfælde.
Produktdetaljer
| Produktnavn | Varenr. | Specifikation |
| Annexin V-FITC/7-AAD Apoptose Detection Kit | 40311ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
| 40302ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| Annexin V-PE/7-AAD Apoptose Detection Kit | 40310ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
| 40303ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| Annexin V-YSFluor™ 488/7-AAD Apoptose Detection Kit | 40313ES60 | 100T |
| 40305ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| 40304ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| Annexin V-YSFluor™ 647/7-AAD Apoptose Detection Kit | 40312ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
| 40306ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| 40307ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| 40308ES20/50/60 | 20T/50T/100T |