Direkte PCR er en reaktion, der direkte bruger blod, dyre- eller plantevæv osv. til amplifikation uden trin til nukleinsyreekstraktion og nukleinsyreoprensning. Det bringer en hidtil uset bekvemmelighed til DNA-amplifikation, hvilket kan spare en masse tid. Så hvad er de reagenser og produkter, der bruges i direkte PCR?

1. Hvad er direkte PCR
2. Hvilke reagenser er nødvendige for direkte PCR
3. Anvendelsesscenarier og karakteristika for Direct PCR Kit
4. Produktdata
5. Kundefeedback
6. Produktbestillingsoplysninger

1. Hvad er direkte PCR

Efter kontinuerlig supplering og forbedring af utallige forskere rundt om i verden, er PCR-teknologi blevet den mest udbredte, hyppigst anvendte og vigtigste grundlæggende forskningsmetode inden for hele det life science-felt. Touch Down PCR, RT-PCR, Real-Time PCR, Multi PCR osv. udviklet baseret på den brede anvendelse af traditionel PCR teknologi, samt den nyeste Digital PCR (Digital PCR), har i høj grad beriget forskningen hos flertallet af videnskabelige forskere. Disse metoder har i høj grad fremskyndet udviklingen af ​​moderne biovidenskab, især molekylærbiologi, og ydet store bidrag til forskningen i liv og natur for hele mennesket. Traditionel PCR-teknologi og forskellige nye teknologier og nye applikationer afledt af den har en forudsætning, det vil sige, at nukleinsyreskabeloner med høj renhed skal opnås på forhånd. Enhver biologisk prøve skal gennemgå en række komplekse og kedelige prøvebehandlinger for at opnå nukleinsyreprøver, der opfylder de tekniske krav til PCR. Adskillelse og ekstraktion af DNA og RNA har altid været det grundlæggende arbejde, som relevant videnskabeligt og teknisk personale skal gentage hver dag. På grund af den enorme forskel mellem prøver er separations- og ekstraktionsprocessen af ​​DNA og RNA også meget forskellig. Dette arbejde kræver et højt niveau af teknisk færdighed for operatørerne. På grund af brugen af ​​nogle meget giftige kemiske reagenser i den traditionelle separations- og ekstraktionsteknologi, vil langvarig eksponering forårsage irreversibel skade på operatørens krop og endda forårsage direkte skade under eksperimentet. Kemiske reagenser som phenol og chloroform er vigtige kræftfremkaldende stoffer i laboratoriet, og det flydende nitrogen, der bruges i processen med nukleinsyreseparation og ekstraktion af plantevæv, udgør en større trussel mod operatørernes sikkerhed under forsøget på grund af dets ultralave temperatur. Samtidig er det en arbejdsintensiv opgave for dem, der har et stort antal prøver at studere, at adskille og udvinde nukleinsyrer. Nu er nukleinsyreisolerings- og ekstraktionssættene på markedet modne, og der er mange mærker, men de er alle nogenlunde ens. Uanset om det er et silicamembransøjlecentrifugalsæt eller et magnetisk perlemetodesæt, kræves der meget tid, og omkostningerne er høje. Ud over prisen på sættet er der særlige krav til laboratorieudstyr. Den automatiserede arbejdsstation, der anvendes i den magnetiske perlemetode, er et meget typisk storstilet højværdiudstyr, hvilket er en stor udgift for laboratoriet. For at opsummere, før man udfører PCR-eksperimenter, er prøveforbehandling en uundgåelig og konstant hovedpine for forskere. Hvordan man løser dette problem og direkte udfører PCR-eksperimenter uden separation og ekstraktion af nukleinsyrer har altid været et problem, som mange videnskabelige forskere og klinisk laboratoriepersonale har tænkt på.

Direkte PCR er en reaktion, hvor dyre- eller plantevæv anvendes direkte til amplifikation uden nukleinsyreekstraktion. På mange måder fungerer direkte PCR som konventionel PCR.Den største forskel er den brugerdefinerede buffer, der bruges i direkte PCR. Prøven kan direkte udsættes for PCR-reaktion uden nukleinsyreekstraktion, men der er tilsvarende krav til tolerancen af ​​de enzymer, der er involveret i den direkte PCR-reaktion, og bufferens kompatibilitet. Selvom der er flere eller færre PCR-hæmmere i almindelige prøver, kan direkte PCR stadig opnå pålidelig amplifikation under påvirkning af enzymer og buffere. Den traditionelle PCR-reaktion skal dog bruge nukleinsyre af høj kvalitet som skabelon for reaktionen. Hvis skabelonen indeholder proteiner og andre urenheder, vil den hæmme PCR-reaktionens glatte fremskridt.

Det tidligste anvendelsesområde for direkte PCR er området for dyr og planter, såsom blod, væv og hår fra mus, katte, høns, kaniner, får, kvæg og andre dyr; blade og frø af planter osv. Det bruges til at studere genotypebestemmelse, transgen, plasmiddetektion, gen-knockout-analyse, DNA-kildeidentifikation, artsidentifikation, SNP-analyse og andre områder. Disse felter har nogle fælles karakteristika, det vil sige, at indholdet af målgenet er relativt højt, og nukleinsyreekstraktion er besværlig. Derfor kan direkte PCR ikke kun spare tid og have ringe indflydelse på resultaterne, men også spare omkostninger.

2. Hvilke reagenser er nødvendige for direkte PCR

2.1 Prøvelysat

Prøvelysatet kan fremstilles af dig selv eller købes. Forskellen i komponenterne i forskellige mærker af lysat vil medføre, at lyseringsevnen bliver forskellig, og så vil lyseringstiden være lidt anderledes. For eksempel til forberedelse af dyrevævsprøver anbefales det generelt at lysere i 30 minutter eller natten over, og lysatet for vira varierer fra 3-10 minutter.

2.2 PCR master mix

Det anbefales at bruge en hot-start DNA-polymerase for at forbedre specifik amplifikation og stærkere amplifikationsevne. I hjertet af direkte PCR er en meget resistent polymerase.

2.3 Fjern eller inhiber komponenter i prøver, der påvirker DNA-amplifikation

Efter at prøven er behandlet af lysatet, vil proteiner, lipider og andre cellerester blive frigivet, og disse stoffer vil hæmme PCR-reaktionen. Derfor skal direkte PCR tilføje tilsvarende fjernelse eller inhibitorer for at reducere indflydelsen af ​​disse faktorer.

3. Anvendelsesscenarier og karakteristika for Direct PCR Kit

Direct PCR Kit fra Yeasen kan direkte amplificere prøverne af planten, dyrevævet eller blodet og andre originale prøver uden nukleinsyreoprensning, hvilket i høj grad forenkler den eksperimentelle PCR-proces. PCR-baseret genotypning (figur 1) blev udført under anvendelse af den originale prøve uden genomoprensning (figur 1A) eller ved anvendelse af dets lysat (figur 1B) som skabelon. Sammenlignet med generel PCR-baseret Genotyping har det direkte PCR-kit mindre prøveforbrug, enkel betjening, lave eksperimentelle omkostninger og kvantitativ prøvedetektion af høj kvalitet.

Figur 1. Direkte PCR-teknologi.

A. Direkte metode: Tag et lille antal prøver og tilføj dem direkte til PCR-blandingen til PCR-identifikation. B. Lysismetode: Tilsæt prøven til lyseringsopløsningen for at frigive genomet, og tilsæt en lille mængde af lysisupernatanten til PCR-blandingen til PCR-identifikation.

3.1 Ansøgninger

Detektion af dyregenamplifikation, transgen dyregenotypning, transgen planteidentifikation, plantegenotypning osv.

3.2 Funktioner

★   Direkte: ingen DNA-oprensning;
★   Hurtig: 10 min til at fuldføre skabelonforberedelse, 50 min til at fuldføre PCR-reaktion;
★   Simpel: Prøver kan lyseres uden klipning eller slibning;
PCR Mix er i form af en mastermix, som reducerer prøvetilsætningstrin
★   Besparelse: mindre materialeforbrug
★   Høj gennemstrømning: lysereaktion kan fuldføres i 96-brønds plade
★   Stærk inhibitortolerance

4. Produktdata

4.1 Multi-dyr universel type: Animal Tissue Direct PCR Kit

4.1.1 Hurtigst: forkort driftstiden

Figur 2. Et animalsk væv direkte PCR-kit fra Yeasen kunne spare mere tid.

4.1.2 Eksempel: Genotypeidentifikation af Knockout-mus

Figur 3. Resultaterne af direkte amplifikation af direkte PCR-kit fra dyrevæv til påvisning af gen-knockout-dyr.

M: 100bp DNA-stige. Bane 1-8: lysat som skabelonen. +: 50 ng oprenset genomisk DNA som skabelon. ﹣: Deioniseret vand som skabelon. Flere cyklusser: 35 cyklusser. Enkelt fragment (580 bp): Knockout-dyrs homozygot genom. Enkelt fragment (180 bp): Vildtype genom. To fragmenter (580bp/180bp): Knockout-dyrets heterozygote genom.

4.2 Gnaverspecifik: Muse Tissue Direct PCR Kit

4.2.1 Hurtigere: Tilstrækkelig genfrigivelse

Figur 4 Direkte amplifikationsresultater af direkte PCR-kit fra musevæv med forskellige lyseringstider.

M: 100bp DNA-stige. +: 50 ng oprenset genomisk DNA som skabelon. Flere cyklusser: 35 cyklusser.

4.2.2 Bedre end den generelle alkaliske lyseringsmetode

Figur 5. SOX21-genamplifikationsresultater af musehale behandlet med forskellige lyseringsmetoder.

M: 100 bp DNA-stige. Bane 1-2: Lysat som skabelon ved generel alkalisk lysis. Bane 3-4: Lysat som en skabelon af musevæv direkte PCR-kit. +: 50 ng oprenset genomisk DNA som skabelon. -: Deioniseret vand som skabelon. Flere cyklusser: 35 cyklusser.

4.2.3 Sammenlign med lignende produkter

Figur 6. SOX21-genamplifikationsresultater af musehale behandlet med lignende produkter fra forskellige mærker.

M: 100 bp DNA-stige. +: 50 ng oprenset genomisk DNA som skabelon. Flere cyklusser: 35 cyklusser.

4.3 Plantevæv direkte PCR-kit

4.3.1 Multi-type planteprøveverifikation

Figur 7. Resultater af direkte amplifikation af blade fra forskellige planter.

M: 100 bp DNA-stige. C: Det oprensede genomiske DNA som skabelon.Bane 1-2: Bladvævslysatet som skabelon. Flere cyklusser: 30 cyklusser.

5. Kundefeedback

5.1 Genotyping af mus

Figur 8. Resultaterne af muse-genotypeidentifikation ved brug af direkte PCR-kit fra musevæv af brugere fra Beijing Jishi Life Technology Co., Ltd.

5.2 Rice Direct PCR

Figur 9. Amplifikation af ris-relaterede gener ved hjælp af plantevæv direkte PCR-sæt af brugere af Huazhong Agricultural University.

6. Produktbestillingsoplysninger

Yeasen er en bioteknologisk virksomhed, der beskæftiger sig med forskning, udvikling, produktion og salg af tre store biologiske reagenser: molekyler, proteiner og celler. Produkterne leveret af Yeasen er som følger.

Tabel 1. Produktbestillingsoplysninger