Da die Menschen immer mehr auf gesundheitliche Belange achten, entwickelt sich der Bereich der In-vitro-Diagnostik (IVD) rasant. Insbesondere das Auftreten von COVID-19 hat die Expansion des IVD-Marktes beschleunigt. Derzeit wird RT-qPCR häufig bei der Entwicklung von IVD-Diagnostikreagenzien verwendet, aber flüssige RT-qPCR-Diagnostikreagenzien haben hohe Transportkosten, eine instabile Leistung und eine kurze Haltbarkeit. Trockenreagenzien können die Mängel von flüssigen RT-qPCR-Diagnostikreagenzien perfekt umgehen. Wie sollten Trockenreagenzien also hergestellt werden? Wie wählt man die Produktionsmethode?

1. Was sind Trocknungsreagenzien?

2. Was ist Lufttrocknung?

3. Was ist Gefriertrocknung?

4. Was ist der Unterschied zwischen Gefriertrocknung und Lufttrocknung?

5. Verwandte Produkte und Leistung

1. Was sind Trocknungsreagenzien?

Trockenreagenzien sind Reagenzien, die man erhält, nachdem die Probe getrocknet und dehydriert wurde. Trockenreagenzien können bei Zimmertemperatur geliefert werden und erfordern keinen Transport in der Kühlkette. So lässt sich wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Reagenzien vermeiden, das ihre Leistung und Haltbarkeit beeinträchtigt, und die Transportkosten werden stark gesenkt. Trockenreagenzien sind nicht nur einfach in der Anwendung, sondern verringern auch die Anforderungen an die Anwender. Die Molekulardiagnostikbranche ist vor allem deshalb an Trockenreagenzien interessiert, weil diese bei Zimmertemperatur transportiert und gelagert werden können. Mittlerweile gibt es zwei weit verbreitete Trocknungsverfahren: Gefriertrocknung und Lufttrocknung. Die Lufttrocknung ist kostengünstiger, während die Gefriertrocknung am weitesten verbreitet ist. Beide Verfahren haben ihre Vorteile. Es gibt zwei Produktionsmethoden für Trockenreagenzien: Lufttrocknung und Gefriertrocknung. Was sind sie und wie sollte man sich entscheiden?

2. Was ist Lufttrocknung?

Lufttrocknung ist eine Trocknungstechnik, die zur Herstellung von Trocknungsreagenzien verwendet werden kann. Lufttrocknung wird in drei Prozesse unterteilt: natürliche Lufttrocknung, Heißlufttrocknung und künstliche natürliche Lufttrocknung. Im industriellen Produktionsprozess wird das Reagenz häufig mit Heißluft getrocknet, um die Stabilität der Produktqualität und -leistung sicherzustellen. Für IVD-Diagnostikreagenzien wird im Allgemeinen ein Präzisionsofen mit Gebläse- oder Vakuumfunktion verwendet, um die Flüssigkeit bei einer Temperatur über der Raumtemperatur zu trocknen (Trocknung bei 50 °C für 80 Minuten). Die Flüssigkeit wird luftgetrocknet und erhält ein viskoses Trockenmaterial. Der spezifische Prozess ist in Abbildung 1 dargestellt.

Abb. 1. Heißlufttrocknung

Beim Trocknen flüssiger molekularer Reagenzien ist es entscheidend, nicht nur sicherzustellen, dass das Enzym nach dem Trocknen schnell hydratisiert werden kann, sondern auch, dass Stabilität, Empfindlichkeit und Spezifität der getrockneten Reagenzien nicht beeinträchtigt werden. Für die Lufttrocknung ist lediglich ein Präzisionsofen erforderlich. Im Vergleich zur Gefriertrocknung ist die Ausrüstung günstiger und der Energieverbrauch geringer, sodass auch die Kosten für die Reagenzien geringer sind. Darüber hinaus ist der Lufttrocknungsprozess einfach und die Trocknungszeit kürzer (innerhalb von 2 Stunden). Die Lufttrocknung hat sowohl Vor- als auch Nachteile. Während des Lufttrocknungsprozesses gehen durch die Verdunstung des Wassers verschiedene Bestandteile, einschließlich der Enzyme, verloren. Darüber hinaus werden die Reaktionslösung und ihre Bestandteile durch die hohe Temperatur von 50 °C geschädigt. Einige Bestandteile oxidieren zudem leichter, sodass die Haltbarkeit luftgetrockneter Reagenzien kürzer ist. Darüber hinaus haben lufttrocknende Reagenzien eine hohe Viskosität, lassen sich leicht an die Wand hängen und haben eine schlechte Rehydratationsfähigkeit.Durch Gefriertrocknung können die Mängel der Lufttrocknung ausgeglichen werden.

3. Was ist Gefriertrocknung?

Im Unterschied zur Lufttrocknung ist die Gefriertrocknung eine spezielle Trocknungstechnologie, deren Grundprinzip auf dem Dreiphasenwechsel von Wasser basiert. Wasser hat drei Phasen: fest, flüssig und gasförmig, und diese drei Phasen können nebeneinander bestehen und sich gegenseitig umwandeln. Bei einem Druck über 610,75 Pa schmilzt Eis bei steigender Temperatur zu Wasser, und Wasser verdunstet und wird zu Dampf. Bei einem Druck unter 610,75 Pa sublimiert das Eis durch Erhitzen direkt zu Wasserdampf. Genauer gesagt, wie in Abbildung 2 gezeigt, macht sich die Gefriertrocknung das Prinzip des Phasenübergangs von Wasser zunutze. Zunächst werden die flüssigen Reagenzien auf -30 bis -40 °C gefroren, sodass der Großteil der Feuchtigkeit im Material zu Eis gefriert. Das Eis sublimiert bei höherem Vakuum zu Wasserdampf, wodurch eine Niedertemperatur-Wärmequelle entsteht. Der Wasserdampf wird durch einen Kondensator im Vakuumsystem kondensiert, sodass andere Materialien im Eis verbleiben, wodurch getrocknete Produkte entstehen.

Abb. 2. Phasendiagramm für Wasser

Was sind also die wichtigsten Formen gefriergetrockneter Reagenzien? Gefriergetrocknete IVD-Reagenzien werden hauptsächlich in drei Formen unterteilt: Gefriergetrocknete Penicillinflaschen, Gefriergetrocknete In-situ-Gefriergetrocknete und gefriergetrocknete Mikrokügelchen. Die drei gefriergetrockneten Formulierungen sind in Abbildung 3 dargestellt. Die unterschiedlichen Formen haben ihre Vor- und Nachteile. Die Gefriergetrocknete Penicillinflaschen ist die am weitesten industrialisierte Form. Sie verfügt nicht nur über vollautomatische Produktionslinien, sondern auch über einen vollständigen Verifizierungs- und Risikokontrollprozess. Der Prozess ist der einfachste und ausgereifteste. Der Nachteil besteht darin, dass die Kosten für eine Penicillinflasche hoch sind und die Füllmenge nicht zu gering sein sollte. Die Menge jedes IVD-Reagenz ist jedoch sehr gering, sodass es für mehrere Portionen abgefüllt oder mehrmals gleichzeitig verwendet werden muss. Wenn es nicht aufgebraucht wird, muss es separat aufbewahrt werden, was nicht sehr praktisch ist.

In-situ-Lyophilisierung bedeutet, dass alle Komponenten des Reagenzes direkt im Kit gefriergetrocknet werden, was die Verwendung erleichtert. Allerdings ist die Verteilung von Kälte und Wärme im Gefriertrockner verzerrt und die Platzierung der Kits ist auch unterschiedlich, sodass die Konsistenz der Chargen schwer zu kontrollieren ist. Darüber hinaus ist die Auslastungsrate von In-situ-Lyophilisatoren sehr niedrig, sodass die Amortisierungskosten hoch sind. Wenn eine große Menge an In-situ-Lyophilisierung durchgeführt wird, werden die gefriergetrockneten Pulver kreuzkontaminiert.

Abb. 3. Form der gefriergetrockneten Reagenzien

Lyophilisierte Mikrosphären können genau quantifiziert werden, für einzelne Personen und Portionen, das Produkt ist bequemer zu verwenden. Es kann auch mit einem speziellen Verfahren behandelt werden, um Feuchtigkeitsaufnahme zu verhindern, eine Lagerung bei Raumtemperatur zu ermöglichen und mehrere Problempunkte gleichzeitig zu lösen. Der Nachteil besteht darin, dass die Entwicklung der Lyophilized Microsphere-Technologie schwierig ist und die Anforderungen an die Prozesskontrolle hoch sind. Lyophilisierte Reagenzien müssen je nach Anwendungsszenario die beste Form wählen. Lyophilized Microsphere hat einzigartige Vorteile und eignet sich für eine Vielzahl von Anwendungsszenarios, die auf dem Markt vielversprechender sind.

4. Was ist der Unterschied zwischen Gefriertrocknung und Lufttrocknung?

Der einzigartige Prozess der Gefriertrocknung bestimmt seine einzigartigen Vorteile. Im Vergleich zur Lufttrocknung ist die Gefriertrocknung der Lufttrocknung in vielerlei Hinsicht überlegen. Die Vorteile der Gefriertrocknung sind wie folgt:

Die Gefriertrocknung wird bei niedriger Temperatur durchgeführt, so dass das Enzym nicht denaturiert wird oder seine biologische Aktivität verliert und die biologische Aktivität vollständig ist.Da das Trocknen im gefrorenen Zustand durchgeführt wird, bleibt das Volumen der Trocknungsreagenzien nahezu unverändert und die ursprüngliche Struktur bleibt ohne Schrumpfung erhalten. Beim Trocknen bei niedriger Temperatur ist der Verlust einiger flüchtiger Bestandteile in den Trocknungsreagenzien sehr gering, was für das Trocknen von Reagenzien geeignet ist. Anorganische Salze werden beim Trocknen nicht auf der Oberfläche des Materials abgeschieden, wodurch eine Oberflächenhärtung des Materials vermieden wird. Das getrocknete Material ist locker und porös, löst sich nach Zugabe von Wasser schnell und vollständig auf und erhält fast sofort seinen ursprünglichen Charakter zurück. Da das Trocknen unter Vakuum mit sehr wenig Sauerstoff durchgeführt wird, bleiben einige leicht oxidierbare Substanzen geschützt. Beim Trocknen können mehr als 95 % bis 99 % der Feuchtigkeit entfernt werden, sodass die getrockneten Produkte lange Zeit ohne Qualitätsverlust gelagert werden können.

Die Hauptunterschiede zwischen Gefriertrocknung und Lufttrocknung sind folgende:

Tabelle 1. Die Unterschiede zwischen Gefriertrocknung und Lufttrocknung

Obwohl gefriergetrocknete Reagenzien mehr kosten und länger dauern, sind die durch Gefriertrocknung hergestellten Reagenzien stabiler und einfacher zu verwenden, was genau der Entwicklungsrichtung von Diagnosereagenzien entspricht. Daher ist diese Technologie seit dem Aufkommen immer beliebter geworden. Sie wird in verschiedenen Bereichen wie Krankheitserkennung, Viren- und Krankheitserregererkennung, Lebensmittelsicherheitserkennung, Tiererkennung und Umwelterkennung häufig eingesetzt.

5. Verwandte Produkte und Leistung

Der Schlüssel sind die Rohstoffe in den IVD-Diagnostikreagenzien.Nicht gefriergetrocknete Materialien können nicht direkt aus gefriergetrockneten Materialien entfernt werden, und jede Komponente muss geprüft und auf Fehler untersucht werden. Daher erhöht Yeasen Biotechnology seine Investitionen in diesem Bereich kontinuierlich und ist bestrebt, seinen Kunden qualitativ hochwertige und stabile gefriergetrocknete Rohstoffe zu liefern, die schnell auf den Markt kommen.

Die zugehörigen Produkte, die Yeasen bereitstellen kann, sind in Tabelle 2 aufgeführt:

Tabelle 2. Produktliste

Hieff Unicon® V Lyo-nCoV Multiplex One Step RT-qPCR Kit (mit MgCl2) (Kat.-Nr. 13775) ist ein glycerinfreies, gefriergetrocknetes (lyo-ready) flüssiges diagnostisches Reagenz. Dieses Produkt ist eine ideale Wahl für die Entwicklung von Multiplex-RT-qPCR, das bei Raumtemperatur stabil ist und bei Raumtemperatur versendet und gelagert werden kann.

Leistung: Die Pseudovirus-Vorlage wurde durch mehrere RT-qPCR unter Verwendung von flüssigen Reagenzien (rot) bzw. 13775 gefriergetrockneten Reagenzien (lila) amplifiziert. Das linke Diagramm zeigt den FAM-Kanal, das rechte den VIC-Kanal. Die Ergebnisse zeigten, dass die Aktivität der 13775 Reagenzien nach der Gefriertrocknung intakt war und sie immer noch über eine hocheffiziente Mehrfachreaktionsfähigkeit verfügten. Genauer gesagt, wie in Abbildung 4 gezeigt.

Abb. 4. Die Leistung des Produkts 13775 nach der Gefriertrocknung

Die 13775 gefriergetrockneten Reagenzien wurden 21 Tage lang für mehrere RT-qPCR-Amplifikationstests bei 37 °C (grün) und -20 °C (blau) aufbewahrt. Das linke Diagramm zeigt den FAM-Kanal, das rechte den VIC-Kanal. Die Ergebnisse zeigten, dass das gefriergetrocknete Reagenz nach 21 Tagen Lagerung bei 37 °C immer noch eine gute Amplifikationswirkung hatte. Genauer gesagt, wie in Abbildung 5 dargestellt.

Abb. 5. Thermische Stabilität des gefriergetrockneten Reagenz 13775 – 37 °C für 21 Tage.

6.Leitfaden zur Produktauswahl

Verfahren	Beschreibung	Produktname	Artikelnummer
Probenverarbeitung	Proteinverdauung	Proteinase K	10401ES
	RNA-Extraktion	Rekombinante DNase I (RNase-frei)	10325ES
	RNase-Hemmung	Muriner RNase-Inhibitor (40 U/μL)	10603ES
Umgekehrte Transkription	Geeignet für RT-qPCR	Hifair V Reverse Transkriptase (200U/ μL)	11300ES
		Hifair V Reverse Transkriptase (600U/ μL) GLyceroL-frei	11301ES
PCR-Amplifikation	Hot-Start-DNA-Polymerase	Hieff UNICON Hotstart E-Taq DNA-Polymerase	10726ES

Zum Thema Lesen:

COVID-19-Nukleinsäure-Nachweisrohstofflösung: schnell, gefriergetrocknet

Yeasen Biology's Gesamtlösung zum Nachweis des Afrikanischen Schweinepestvirus

Afrikanisches Schweinepestvirus – Total Master Mix/Direktamplifikations-qPCR-Lösung