I. Prinzipien des Western Blot
Western Blot (WB) oder Protein-Immunoblotting ist ein klassisches Verfahren zum Nachweis spezifischer Proteine auf Basis von Antigen-Antikörper-Interaktionen und wird häufig in der Molekularbiologie, Immunologie und verwandten Bereichen eingesetzt. Zu den wichtigsten Schritten gehören:
- Proteintrennung:
- SDS-PAGE trennt denaturierte Proteine nach Molekulargewicht.
- SDS überzieht Proteine mit einer gleichmäßigen negativen Ladung und eliminiert so strukturelle Einflüsse.
- Membrantransfer:
- Proteine werden vom Gel auf eine Membran (z. B. PVDF oder Nitrocellulose) übertragen.
- Antikörpernachweis:
- Primäre Antikörper binden spezifisch das Zielprotein, gefolgt von enzymkonjugierten sekundären Antikörpern (z. B. HRP), die ein nachweisbares Signal wie Chemilumineszenz erzeugen.
II. Standard-Western-Blot-Workflow
| Schritt | Wichtige Verfahren | Empfohlene Reagenzien ( |
| 1. Probenvorbereitung | Extrahieren Sie Proteine mit RIPA-Lysepuffer; fügen Sie PMSF hinzu, um Proteasen zu hemmen Aktivität. | RIPA Lysis Buffer Series, PMSF |
| 2. Proteinquantifizierung | Verwenden Sie die BCA-Methode (Kat.-Nr. 20200ES) zur Quantifizierung; Standardverdünnungspuffer an Probenpuffer anpassen. | BCA-Quantifizierungskits (Kat.-Nr. 20200ES/20201ES) |
| 3. SDS-PAGE-Elektrophorese | Verwenden Sie vorgegossene Gele und lassen Sie diese bei 150 V laufen, bis der Farbstoff den Gelboden erreicht. | Fertiggele, SDS-PAGE-Ladepuffer |
| 4. Membrantransfer und Blockierung | PVDF-Membran aktivieren (Kat.-Nr. 36125ES) durch Einweichen in Methanol für 1 Minute; Transfer bei 300 mA für 60 Minuten in einem Eisbad; Blockieren bei Raumtemperatur (RT) für 1 Stunde oder Verwenden einer schnellen Blockierungslösung (Kat.-Nr. 36122ES) für 10 Minuten. | TrAntwortpuffer, PVDF-Membranserie |
| 5. Antikörper-Inkubation | Mit Primärantikörper über Nacht bei 4 °C inkubieren, mit Sekundärantikörper 1–2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren, 3x gründlich mit TBST waschen. | Antikörperverdünner |
| 6.Proteinnachweis | Entwickeln mit ECL (Kat.-Nr. 36208ES). | ECL-Chemilumineszenz-Serie |
Abbildung 1: Western Blot-Arbeitsablauf
III. Häufige Probleme und Lösungen
| Ausgabe | Mögliche Ursachen | Lösungen |
| Hoher Hintergrund  | Unvollständige Blockierung | Verwenden Sie frische Blockierlösung und verlängern Sie die Blockierzeit. |
| Unzureichendes Waschen | Erhöhen Sie die Waschhäufigkeit und -dauer, um unspezifische Bindungen zu entfernen. | |
| Übermäßige Konzentration primärer Antikörper | Verdünnen Sie den Antikörper auf eine geeignete Konzentration. | |
| Probleme mit der Probenqualität | Überprüfen Sie die Reinheit und Qualität der Proben. Verwenden Sie frische Proben. | |
| Membrantrocknung | Stellen Sie sicher, dass die Membran während der Inkubationsschritte hydratisiert bleibt und stellen Sie den vollständigen Kontakt mit den Reaktionslösungen sicher. | |
| Schwaches oder kein Signal  | Unvollständige Übertragung | Überprüfen Sie die Übertragungseffizienz und passen Sie die Zeit nach Bedarf an. |
| Nicht aktivierte PVDF-Membran | Weichen Sie PVDF zur Aktivierung in Methanol ein, bevor Sie es in den Puffer übertragen. | |
| Primäre Antikörperfehlpaarung mit Zielspezies | Überprüfen Sie das Datenblatt, vergleichen Sie Immunogen- und Proteinsequenzen und fügen Sie eine weit verbreitete positive Kontrolle (z. B. β-Actin in Säugetierzellen). | |
| Primäre und sekundäre Antikörperinkompatibilität | Stellen Sie sicher, dass der Sekundärantikörper mit der Wirtsspezies des Primärantikörpers übereinstimmt. | |
| Unzureichende Antikörperbindung | Erhöhen Sie die Antikörperkonzentration und verlängern Sie die Inkubation bei 4 °C (z. B. über Nacht). | |
| Niedrige Antigenwerte | Tragen Sie mindestens 20–30 μg Protein pro Spur auf; verwenden Sie Proteaseinhibitoren und eine positive Kontrolle. | |
| Geringe Zielproteinexpression | Bestätigen Sie die Expression in der Probe anhand der Literatur/Datenbank. Konzentrieren Sie die Probe oder verwenden Sie eine Kontrolle mit hoher Expression. | |
| Unspezifische Bänder/Mehrere Bänder  | Überpassagierte Zelllinien verändern Proteinprofile | Verwenden Sie Zellen mit geringer Passagerate (<15 Passagen) und führen Sie parallele Kontrollen mit Beständen mit früher Passagerate durch. |
| Proteinabbau | Proteaseinhibitoren in Lysepuffer einschließen; bei -80 °C lagern, Einfrieren und Auftauen vermeiden, frische Proben verwenden. | |
| Posttranslationale Modifikationen | Suchen Sie in der Literatur nach Modifikationen, die die Bandgröße beeinflussen (z. B. Ubiquitinierung, Glykosylierung). | |
| Mehrere Spleißvarianten | Spleißvarianten anhand von Literatur oder Datenbanken verifizieren. | |
| Proteindimere/-multimere | Fügen Sie dem SDS-Ladepuffer frisches β-Mercaptoethanol oder DTT hinzu. | |
| Exogene Proteinkontamination | Auf exogene Proteine prüfen; bei Bedarf die Zelllinien wechseln. | |
| Übermäßige Probenbeladung | Optimieren Sie die Beladung (20–30 μg) basierend auf der Zielexpression durch Gradiententests. | |
| Multimerbildung | Kochen Sie die Proben 10 Minuten lang, um Multimere zu dissoziieren | |
| Hohe Konzentration primärer Antikörper | Reduzieren Sie die Konzentration und/oder Inkubationszeit, um zusätzliche Bänder zu vermeiden. | |
| Hohe Konzentration sekundärer Antikörper | Niedrigere Konzentration und Einbeziehung einer ausschließlich sekundären Kontrolle zur Reduzierung der unspezifischen Bindung. | |
| Erkennung nicht gemeldeter Proteine oder Familienmitglieder | Lesen Sie die Literatur oder BLAST; verwenden Sie empfohlene Zelllinien/Gewebe. | |
| Wenn dies bestätigt wird, haben Sie möglicherweise ein neues Protein entdeckt! | ||
| Lächelnde Bands  | Schnelle Migration, hohe Puffertemperatur, Überlastung, niedriger Puffer | Migration verlangsamen, Puffer vorkühlen, Proteinbelastung reduzieren, sicherstellen, dass der Puffer die Vertiefungen vollständig bedeckt. |
| Stirnrunzelnde Bänder  | Geräteprobleme (z. B. Blasen unter dem Gel) | Passen Sie das Setup an, um Blasen zu vermeiden und eine gleichmäßige Gelpolymerisation sicherzustellen. |
| Tailing Bands  | Schlechte Probenlöslichkeit, Abbau, wiederverwendeter Puffer | Proben gut mischen, frische Proben verwenden, frischen Laufpuffer zubereiten. |
| Hantelförmige Bänder  | Ungleichmäßiges Gel Polymerisation, unreine Proben | Gel zur Gleichmäßigkeit neu gießen; Proben vor Gebrauch zentrifugieren. |
| Bandverschmierung  | Übermäßige Beladung, schlechte Gelqualität | Reduzieren Sie das Probenvolumen und verbessern Sie die Gelvorbereitung. |
| Blasenflecken  | Lufteinschluss während der Übertragung | Entfernen Sie Blasen beim Zusammenbau des Transfersandwiches. |
| Ungleichmäßige schwarze Flecken  | Ungelöste Blockierungslösung, ungleichmäßige Antikörperverteilung | Blockierungslösung vollständig auflösen, 3x mit TBST waschen, während der Inkubation schütteln. |
| Weiße Flecken  | Hohe Antikörperkonzentration erschöpft das Substrat | Niedrigere primäre/sekundäre Antikörperkonzentrationen. |
Ⅳ.Tools zur Produktauswahl und -optimierung
Verwandte Produkte:
| Prozeduren | Kat.-Nr. | Produktname | Technische Daten |
| Probenvorbereitung | 20101ES | RIPA-Lysepuffer (stark) | 100 ml |
| 20115ES | RIPA-Lysepuffer (mittel) | 100 ml | |
| 20114ES | RIPA-Lysepuffer (schwach) | 100 ml | |
| 20118ES | Lysepuffer für WB/IP-Assays | 100 ml | |
| BCA Proteinquantifizierungskit (erweitert) | 500 T/2500 T/5000 T | ||
| BCA-Proteinquantifizierungskit (gebrauchsfertig) | 500 T | ||
| SDS-PAGE-Elektrophorese | Gold Band Plus 3-farbiger Proteinmarker mit regulärem Bereich (8–180 kDa) | 250 μL/2×250 μL/10×250 μL | |
| GoldBand™ 3-farbiger Proteinmarker mit hohem Bereich (10–245 kDa) | 2×250 μL/10×250 μL | ||
| 20328ES | SDS-PAGE-Gel-Vorbereitungskit | 1 Kit (30–50 Gele)/ 1 Kit (150–250 Gele) | |
| PAGE Gel Schnellvorbereitungsset | Konzentrationen: 8 %、10 %、12,5 %、15 % | ||
| 36259ES-36280ES | Fertigprotein Plus Gel | Konzentrationen: 8%, 10%, 12%, 4-12%, 4-20% Ladebrunnen-Optionen: 10 Brunnen, 12 Brunnen, 15 Brunnen | |
|
Membrantransfer und Blockierung | 0,45 μm PVDF-Membran (1 Rolle, 30 cm × 3 m) | 1 Rolle | |
| 0,22 μm PVDF-Membran (1 Rolle, 30 cm × 3 m) | 1 Rolle | ||
| Antikörper-Inkubation | 36206ES | Primäres und sekundäres Antikörperverdünnungsmittel für WB | 100 ml/500 ml |
|
Proteinnachweis | Super-ECL-Nachweisreagenz | 100 ml/500 ml | |
| Verbessertes ECL-Chemilumineszenzsubstrat-Kit | 100 ml/500 ml |
V.So erhalten Sie Unterstützung
Zur individuellen Fehlerbehebung oder Protokolloptimierung:
- Besuchen:
Yeasen Western Blot-Produktseite - E-Mail: info@yeasenbio.com
Goldene Regel für den Erfolg: Standardisierte Verfahren + hochwertige Reagenzien + schrittweise Validierung = reproduzierbare WB-Ergebnisse!
