Das Center for Drug Evaluation (CDE) der National Medical Products Administration hat in seinen Richtlinien für Gentherapieprodukte klar zum Ausdruck gebracht, dass es notwendig ist, die Menge an DNA-Rückständen und die Größe der Restfragmente zu kontrollieren, und empfiehlt, die Größe der DNA-Restfragmente so weit wie möglich unter 200 bp zu halten. Daher ist die Entfernung von Restnukleinsäuren in Biopharmazeutika äußerst wichtig. Mit der zunehmenden Komplexität der Produktionsprozesse steht die effektive Entfernung von Restnukleinsäuren in Umgebungen mit hohem Salzgehalt vor zahlreichen neuen Herausforderungen:
- Während des Reinigungsprozesses von AAV-Viren werden zur Verbesserung der Virusausbeute häufig Puffer mit höheren Salzkonzentrationen (200-500 mM) verwendet. Herkömmliche Nukleasen zeigen jedoch mit zunehmender Salzkonzentration eine deutliche Abnahme der Aktivität. Wenn der Reinigungseffekt durch Erhöhung der Enzymmenge und der Inkubationszeit verbessert werden soll, erhöht dies die Kosten erheblich.
- Wirts-DNA liegt normalerweise in Form von Chromatin vor und wird leicht von Proteinen eingekapselt, wodurch die DNA unzugänglich wird. In Umgebungen mit hohem Salzgehalt können sich Nukleinsäuren und Proteine effektiv trennen, wodurch Restnukleinsäuren besser entfernt werden können
- Virusvektoren wie AAV können aufgrund elektrostatischer Wechselwirkungen aggregieren. Diese Aggregation tritt eher bei geringer Ionenstärke und Rest-DNA-Bedingungen auf, was zu verringerter Stabilität führt und die Ausbeute beeinträchtigt. Eine Erhöhung der Salzkonzentration kann die Aggregation von AAV-Viruspartikeln wirksam reduzieren und so die Rückgewinnungsrate von AAV-Viruspartikeln verbessern.
Salt Active UltraNuclease (salztolerante Breitspektrum-Nuklease) ist eine rekombinante unspezifische Endonuklease, die aus marinen Mikroorganismen gewonnen wird. Im Vergleich zu UltraNuclease weist sie optimale Aktivität bei einer Salzkonzentration von 500 mM auf und kann Nukleinsäureverunreinigungen auch in salzreichen Umgebungen effizient entfernen.
Produktanwendungsszenarien
- Entfernung von Nukleinsäurerückständen in Biologika: Bei der Herstellung von Biologika wie Viren, Impfstoffen und Proteinen kann UltraNuclease hinzugefügt werden, um Nukleinsäurerückstände abzubauen. Dieser Schritt erhöht nicht nur die Virenausbeute, sondern reduziert auch den Gehalt an Nukleinsäurerückständen erheblich und gewährleistet so die Sicherheit und Wirksamkeit der Medikamente.
- Viskositätsreduzierung: Durch den Abbau von Nukleinsäuren wird die Viskosität von Zelllysaten reduziert, was Filtrations-/Ultrafiltrationsprozesse bei der Reinigung von zellabgeleiteten Partikeln wie Viren, AAV-Vektoren und Einschlusskörpern erleichtert.
- Verbesserte Auflösung und Wiederfindung: Bei ELISA-, zweidimensionalen Elektrophorese- und Immunoblot-Analysen verbessert es die Auflösung und Wiederfindung.
- Verhinderung der Zellaggregation: UltraNuclease kann die Aggregation menschlicher peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMCs) wirksam verhindern.
Produktleistungstests
Der Einfluss einer salzreichen Umgebung auf die Enzymaktivität (Na+)
Passend zur Verwendung von Salt Active UltraNuclease hat
Zu diesem Zweck hat
Der experimentelle Prozess zum Erkennen von Resten von Salt Active UltraNuclease mit dem Salt Active UltraNuclease ELISA Kit.
Eigenschaften des UltraNuclease- und Salt Active UltraNuclease ELISA-Kits:
Einhaltung gesetzlicher Vorschriften: Vollständig gemäß den gesetzlichen Anforderungen validiert, Validierungsberichte sind verfügbar;
Qualitätssicherung: Alle Rohstoffe für das Kit werden unabhängig entwickelt, wodurch eine kontrollierbare Qualität gewährleistet wird.
Hohe Empfindlichkeit: Quantitativer Grenzwert von nur 23 pg/ml;
Hohe Präzision: Hohe Wiederholbarkeit innerhalb einer Charge und geringe Variabilität zwischen den Chargen;
Starke Spezifität: Keine Kreuzreaktivität mit anderen gentechnisch veränderten Zellproteinen
Leistungsparameter
| Produktparameter | Inhalt |
| Untersuchungszeit | 3,5 Stunden |
| Assay-Prinzip | Zwei-Stellen-Immunenzymtest |
| Signalverstärkung | Biotin-Streptavidin-System |
| Detektionswellenlänge | 450 nm und 630 nm |
| Empfindlichkeit | 0,024 ng/ml |
| Erfassungsbereich | 0.047 ng/ml~3 ng/ml |
| Erkennungsobjekt | Salzaktive UltraNuclease |
| Anwendbares Instrument | Molekulare Geräte: M- und i-Serie |
| Anwendung | Nachweis von Restnukleasen in Aufreinigungsprozessen von Zell- und Gentherapie sowie rekombinanten Adeno-assoziierten Virusimpfstoffen |
Produktdaten:
Standardkurve des Reagenzienkits:
Spezifität
Die Kreuzreaktivität zwischen dem Salt Active UltraNuclease-Antikörper und den sieben Proteinen im Kit wurde mithilfe dieses Kits ausgewertet, um die in den sieben Prozessen hinzugefügten Proteine zu erkennen. Eine positive Kontrolle (PC-0,047 ng/ml) und eine negative Kontrolle (NC-0 ng/ml) wurden eingerichtet.
Die Ergebnisse zeigten, dass das in den 7 Prozessen zugesetzte Protein nahe an der Negativkontrolle (NC-0 ng/mL) lag, die Nachweiskonzentration niedriger als die Bestimmungsgrenze dieses Kits (0,047 ng/mL) war und keine Kreuzreaktion auftrat. beobachtet.
SHecht Wiederfindungsrate:
Fügen Sie den beiden vom Kunden für das Spike-Recovery-Experiment bereitgestellten Proben drei Konzentrationsstandards (d. h. Std1 3 ng/ml, Std3 0,75 ng/ml und Std5 0,188 ng/ml) in gleichen Anteilen hinzu. Die Ergebnisse zeigen, dass die Spike-Recovery-Raten alle zwischen 80 % und 120 % liegen. Spike-Recovery-Rate % = (gemessener Wert der gespikten Probe – gemessener Wert der nicht gespikten Probe) / theoretischer Wert (Menge des hinzugefügten Standards) * 100 %.
| Beispielname | Testkonzentration von Salt Active UltraNuclease (ng/ml) | Menge des Standards (ng/mL) | Testergebnis (ng/mL) | Spike-Wiederherstellungsrate (%) |
| TS1 | 0,04 | 3 | 1,71 | 114,00 % |
| 0,75 | 0,347 | 92,53 % | ||
| 0,188 | 0,085 | 90,43 % | ||
| TS2 | 0,08 | 3 | 1.772 | 118,13 % |
| 0,75 | 0,405 | 108,00 % | ||
| 0,188 | 0,104 | 110,64 % |
Genauigkeit
1) Wiederholbarkeit
Drei Salt Active UltraNuclease-Standardprodukte mit hoher, mittlerer und niedriger Konzentration wurden für wiederholte Experimente ausgewählt. Im selben Experiment wurden die Proben jeder Konzentration 10 Mal getestet und der CV% lag unter 10 %.
| Unterschied innerhalb der Charge | |||
| Theoretische Konzentration (ng/ml) | Anzahl der Wiederholungen | Durchschnitt (ng/mL) | Variationskoeffizient CV (%) |
| 1.5 | 10 | 1.444 | 2,97 % |
| 0,188 | 10 | 0,196 | 2,27 % |
| 0,047 | 10 | 0,051 | 2,56 % |
2) Mittlere Präzision
Für drei Experimente wurden verschiedene Kitchargen verwendet. Jedes Experiment wurde mit drei Konzentrationen durchgeführt: hoch, mittel und niedrig. Jede Konzentration wurde zehnmal wiederholt. Von jedem Konzentrationspunkt wurden insgesamt 30 Daten erhalten. Der CV% jeder Konzentration betrug weniger als 15 %.
| Chargenunterschied | |||
| Theoretische Konzentration (ng/ml) | Anzahl der Experimente | Durchschnitt (ng/mL) | Variationskoeffizient CV (%) |
| 1.5 | 3 | 1.423 | 5,70 % |
| 0,188 | 3 | 0,212 | 5,59 % |
| 0,047 | 3 | 0,059 | 6,82 % |
Produktinformationen
| Produktname | Produkt Nummer | Produktspezifikationen |
| 20159ES25/50/60/80/90 | 25 KU/50 KU/100 KU/1MU/5MU | |
| 36703ES96 | 96T |
Andere verwandte Produkte
| Produktname | Produktnummer | Produktspezifikationen |
| 20157ES25/50/60/80/90 | 25 KU/50 KU/100 KU/1MU/5MU | |
| 36701ES59 | 96T |