Beschreibung
T7-RNA-Polymerase verwendet doppelsträngige DNA, die die T7-Promotorsequenz (5'-TAATACGACTCACTATAG*-3') enthält, als Vorlage und NTPs als Substrate, um RNA zu synthetisieren, die komplementär zum umgekehrten Strang der DNA hinter dem Promotor ist. Sowohl lineare doppelsträngige DNA mit glatten Enden als auch 5'-Überhänge können als Vorlagensubstrate für die T7-RNA-Polymerase dienen, d. h. linearisierte Plasmide oder PCR-Produkte können als Vorlagen für die RNA-Synthese in vitro verwendet werden.
Dieses Kit verwendet ein Sandwich-Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)-Prinzip zum Nachweis von Resten der T7-RNA-Polymerase. T7-RNA-Polymerase-Standards und Testproben werden in Mikrotiterplattenvertiefungen gegeben, die mit Anti-T7-RNA-Polymerase-Antikörpern (36705-A) vorbeschichtet sind. Anschließend werden verdünnte, biotinmarkierte T7-RNA-Polymerase-Nachweisantikörper (36705-C) hinzugefügt, gefolgt von Streptavidin-HRP (SA-HRP) (36705-D), wodurch ein Komplex aus Antikörper + Antigen + Antikörper-Biotin + SA-HRP entsteht. Nach dem Waschen wird TMB-Substrat (36705-H) zur Farbentwicklung hinzugefügt. TMB wird durch HRP katalysiert und wechselt von farblos zu blau und schließlich zu gelb nach Zugabe der Stopplösung (36705-I). Die Intensität der gelben Farbe korreliert positiv mit der Menge der in der Probe nachgewiesenen T7-RNA-Polymerase.
Komponenten
| NEIN. | Name | 36705ES48 | 36705ES96 |
| 36705-A | Mit Anti-T7-RNA-Polymerase beschichtete Mikrotiterstreifen | 48 T | 96 T |
| 36705-B* | Standard: T7 RNA-Polymerase | 1 Phiole | 2 Phiole |
| 36705-C | Erkennung Antikörper:Biotin-konjugiert Antikörper | 60 μL | 120 μL |
| 36705-D | Streptavidin-HRP | 30 μL | 60 μL |
| 36705-E | Verdünnungspuffer 1 | 25 ml | 45 ml |
| 36705-F | WaschpufferkonzentratPreis (20×) | 25 ml | 50 ml |
| 36705-G | Verdünnungspuffer 2 | 15 ml | 30 ml |
| 36705-H | TMB-Substrat | 8 ml | 15 ml |
| 36705-I | Lösung stoppen | 5 ml | 10 ml |
| 36705-J | Plattenversiegler | je 3 | je 5 |
*Der Standard 36705-B ist ein gefriergetrocknetes Pulver.
Kompatibel mit T7-RNA-Polymerase: 10625, 10628 Und 10629.
Validierungsdaten
Tabelle 1. Linearitätsbereich: 1–32 ng/ml ，R2 = 0,999 ，CV ≤ 5 %.
| Std | Konz.（ ng/ml） | Durchschnitt（ ng/ml） | Erholung（%） | CV% |
| Std1 | 32 | 31.965 | 99,9 % | 2,2 % |
| Std2 | 16 | 16.070 | 100,5 % | 5,0 % |
| Std3 | 8 | 7.812 | 97,7 % | 2,1 % |
| Std4 | 4 | 4.192 | 104,8 % | 0,8 % |
| Std5 | 2 | 2.020 | 101,8 % | 3,5 % |
| Std6 | 1 | 1.173 | 117,3 % | 0,0 % |
| NC | 0 | / | / | / |
Tabelle 2. Hohe Spezifität
| Proteinname | Konz. | Erkannt oder nicht |
| Ppositiv CKontrolle | 1 ng/ml | Erkannt |
| Nnegativ CKontrolle | 0 ng/ml | und |
| UltraNuclease | 10 μg/ml | und |
| Salz Aktive UltraNuklease | 10 μg/ml | und |
| DNAse ICH | 10 μg/ml | und |
| Muriner RNase-Inhibitor | 10 μg/ml | und |
| Vaccinia-Capping-Enzym | 10 μg/ml | und |
| Anorganische Pyrophosphatase | 10 μg/ml | und |
| mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase | 10 μg/ml | und |
| 1 % Körperfett | 10 Mg/ml | und |
Tabelle 3. LOQ: Die Bestimmungsgrenze für dieses Produkt wird durch Verdünnung des niedrigsten Konzentrationspunkts der Standardkurve ermittelt, bei dem der Variationskoeffizient (CV) bei der niedrigsten Konzentration weniger als 20 % beträgt. Dies wird als Bestimmungsgrenze definiert und beträgt 1 ng/ml.
| Std6 theoretischer Wert (ng/ml) | Std 6 Testmittelwert (ng/ml) | Test Wiederholungen | CV% | Erholung |
| 1 | 0,858 | 24 | 12,6 % | 85,8 % |
Tabelle 4. LOD: Die Nachweisgrenze dieses Produkts ist definiert als die Standardkonzentration, die dem mittleren Nachweiswert der Negativkontrolle (NC) plus der zweifachen Standardabweichung entspricht. Durch Messen von 24 NC-Standards und Berechnen des Mittelwerts und der Standardabweichung wird die Nachweisgrenze auf 0,318 ng/ml festgelegt.
| Mittelwert（Außen） | SD（Außen） | Mittelwert +2SD (OD) | Mittelwert +2SD (ng/ml) |
| 0,0527 | 0,0038 | 0,0604 | 0,3176 |
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