Los micoplasmas, también conocidos como organismos similares a la pleuroneumonía (PPLO), son los procariotas más pequeños y simples descubiertos hasta ahora que carecen de pared celular. Tienen un diámetro de 0,1 a 0,3 μm, pueden atravesar filtros y presentan un alto pleomorfismo. Son contaminantes bacterianos relativamente comunes y difíciles de detectar en cultivos de células de mamíferos.
La contaminación por micoplasma tiene múltiples efectos adversos en los cultivos celulares y se ha convertido en un problema grave en las prácticas de cultivo celular. Se estima de manera conservadora que la tasa de contaminación por micoplasma en cultivos celulares rutinarios varía entre el 15% y el 35%, lo que interfiere seriamente con la credibilidad de los resultados experimentales.
Aproximadamente el 95% de la contaminación por micoplasma en cultivos celulares es causada principalmente por Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma arginini, Mycoplasma orale, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma hominis y Mycoplasma hyorhinis. En los medios de cultivo, las colonias de micoplasma forman una especie de "huevo frito". Los sobrenadantes de los cultivos celulares y las membranas celulares proporcionan un entorno adecuado para el crecimiento de los micoplasmas, y los micoplasmas que parasitan la superficie de las células pueden penetrar la membrana de la célula huésped.
Las principales fuentes de contaminación por micoplasma incluyen: medios de cultivo celular o sus componentes (como materias primas para el medio, suero y otros reactivos), personal de laboratorio, incubadoras de cultivos celulares, tanques de almacenamiento de nitrógeno líquido, partículas en el aire y aerosoles, uso excesivo de antibióticos, cultivos celulares mal sellados y células que ya están contaminadas con micoplasma.
Entretanto, los peligros correspondientes a estas contaminaciones incluyen: provocar el descarte de lotes de productos celulares o productos producidos utilizando células como medio debido a la incapacidad de eliminar eficazmente el micoplasma durante la purificación posterior; contaminar todos los equipos e instalaciones relacionados, así como los productos intermedios o finales, que entran en contacto con el material contaminado; provocar que otras células normales se contaminen con micoplasma; provocar el descarte de importantes bancos de semillas de células o virus debido a la contaminación por micoplasma; obligar al laboratorio a detener la producción o las operaciones experimentales para abordar la contaminación por micoplasma; provocar el desarrollo de resistencia al micoplasma, lo que dificulta aún más su eliminación; ampliar el área de contaminación por micoplasma; y representar una amenaza para otros cultivos celulares en el laboratorio.
Por lo tanto, se deben realizar pruebas y eliminaciones periódicas de micoplasma para garantizar que no haya micoplasma presente en el sistema de cultivo celular, lo cual es esencial para el progreso normal de la investigación científica.
Micoplasma Detección
El micoplasma es un tipo de contaminación relativamente común, pero normalmente difícil de eliminar. En el caso de los procesos biológicos que implican cultivos celulares, las reglamentaciones exigen que "no debe haber contaminación por micoplasma".
- La edición de 2020 de la Farmacopea China, Volumen III, 'Preparación y control de calidad de sustratos de células animales para la producción y prueba de productos biológicos', estipula que para las células utilizadas en la producción, las pruebas de micoplasma deben realizarse en el banco de células maestro (MCB), el banco de células de trabajo (WCB) y las células de final de producción (EOPC).
- La FDA, Guía para la industria: Caracterización y calificación de sustratos celulares y otros materiales biológicos utilizados en la producción de vacunas virales para indicaciones de enfermedades infecciosas, estipula que el control de micoplasma debe realizarse en materias primas, semillas de virus, fluidos de cosecha sin procesar y otros materiales similares.
- ICH Q5D, 'Derivación y caracterización de sustratos celulares utilizados para la producción de productos biotecnológicos/biológicos', también menciona que el control de micoplasma debe realizarse en materias primas, semillas de virus, fluidos de cosecha sin procesar y otros materiales similares.
Figura 1 Puntos de prueba de contaminación por micoplasma requeridos por las regulaciones nacionales e internacionales
Los métodos tradicionales de detección de micoplasma incluyen principalmente métodos de cultivo y métodos de células indicadoras. Sin embargo, debido a los largos ciclos de detección o problemas de sensibilidad de estos dos métodos, conducen a ciclos de producción o lanzamiento de productos más largos para las empresas. Con el desarrollo de la terapia celular y génica, los requisitos de la industria en cuanto a la puntualidad y sensibilidad de la detección de micoplasma se han vuelto cada vez más estrictos. Las vidas útiles cortas no son suficientes para soportar períodos de detección tan largos, por lo que el método rápido NAT (Nucleic Acid Testing) se ha destacado entre varios métodos de detección de micoplasma.
Figura 2 Métodos de detección de micoplasma enumerados en las reglamentaciones nacionales e internacionales
Basándose en NAT (técnicas de amplificación de ácidos nucleicos), Yeasen ha desarrollado una serie de kits de detección rápida de micoplasma, incluido el kit de detección de micoplasma qPCR en tiempo real, el kit de detección de micoplasma MycAway™ Plus-Color One-Step y el kit de prueba de micoplasma GMyc-PCR.
1.Kit de detección de micoplasma mediante qPCR en tiempo realEs un producto para la detección cualitativa rápida de posibles contaminaciones por micoplasma en materias primas de producción, bancos de células, semillas virales, fluidos de recolección de células o virus y células terapéuticas. Se utiliza principalmente en los procesos de investigación, desarrollo, producción y liberación de productos biofarmacéuticos.
Calificaciones del producto
Cumplimiento normativo: Validado de acuerdo con los requisitos de las farmacopeas EP2.6.7, JP G3 y USP 63, cumpliendo con los estándares de organizaciones autorizadas internacionales.
Cumplimiento de auditoría: La producción del producto cumple con los estándares del sistema de gestión de calidad ISO13485 y está respaldada por una documentación de auditoría completa.
Seguro de calidad: Todas las materias primas enzimáticas necesarias para el kit son de producción propia y han sido industrializadas, lo que garantiza un suministro estable.
Acumulación de experiencia técnica: El método TaqMan tiene una base técnica sólida y la sensibilidad del kit puede alcanzar 10 UFC/mL o menos.
Centrarse en el rendimiento del producto: La biblioteca de anticuerpos enzimáticos Taq, con anticuerpos de doble bloqueo, mejora la especificidad, la sensibilidad y la estabilidad del kit.
Características del producto
Múltiples tipos de detección: Las sondas TaqMan optimizadas pueden detectar hasta 183 especies de micoplasma.
Fácil de usar: El tiempo total de preparación y prueba de la muestra es inferior a 3 horas, lo que elimina la necesidad de una espera de 28 días asociada con los métodos de cultivo.
Alta sensibilidad: El límite de detección es tan bajo como 10 UFC/mL, lo que lo convierte en una alternativa viable a los métodos de cultivo directo.
Alta especificidad: Los cebadores y las sondas están diseñados para apuntar al ARNr 16S, lo que garantiza que no haya reacción cruzada con especies estrechamente relacionadas, como clostridios y lactobacilos.
Alta seguridad: El control positivo (CP) del kit no es infeccioso, lo que elimina por completo el riesgo de contaminación.
Fuerte resistencia a interferencias: La introducción de un control interno (CI) ayuda a excluir interferencias y anomalías en la preparación de la reacción, evitando eficazmente los falsos negativos.
Figura 3 Flujo de trabajo para la detección de micoplasma utilizando el kit de detección de qPCR en tiempo real de micoplasma
2. Kit de detección de micoplasma en un solo paso MycAway™ Plus-ColorEmplea una tecnología de amplificación isotérmica única, que ofrece una mayor discriminación de colores. El cambio de azul violeta (negativo) a azul cielo (positivo) es más fácil de discernir a simple vista. Además, incluye componentes anticontaminación para eliminar la aparición de falsos positivos.
Figura 4: Procedimiento de operación para la detección de micoplasma con el kit de detección de micoplasma de un solo paso MycAway™ Plus-Color
3. PCR GMyc de micoplasma DetecciónEquipoA diferencia de los métodos de detección de PCR de un solo paso convencionales, el número de cebadores se incrementa de un par a tres pares, y se dirigen a las regiones conservadas del ARNr 16S y 23S de micoplasma para la amplificación por PCR anidada. Esto no solo reduce los productos no específicos, sino que también mejora significativamente la sensibilidad del producto, lo que permite la detección de tan solo una copia de micoplasma.
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Figura 5 Procedimiento de operación para la detección de micoplasma utilizando el kit de prueba de micoplasma GMyc-PCR
Eliminación de micoplasma
En el proceso de cultivo celular, las pruebas periódicas pueden prevenir eficazmente la contaminación a gran escala por micoplasma. Sin embargo, si las células ya están contaminadas con micoplasma, es necesario manipularlas con prontitud. La mejor práctica es esterilizar las células contaminadas a alta presión y luego desecharlas para evitar contaminar otras líneas celulares limpias. Si las células contaminadas son particularmente valiosas y es necesario eliminar la contaminación por micoplasma, se puede utilizar una combinación de antibióticos para lograr este objetivo. Dado que los micoplasmas carecen de pared celular, los antibióticos tradicionales generalmente son ineficaces contra ellos. Por lo tanto, es fundamental seleccionar un reactivo de eliminación de micoplasma adecuado.
El tratamiento MycAway™ de Yeasen (1000×) es una preparación antibiótica mixta que contiene tres componentes con efectos antimicrobianos sobre el micoplasma: quinolonas, derivados de la tetraciclina y antibióticos macrólidos. Este reactivo de eliminación del micoplasma logra una eliminación eficaz del micoplasma al inhibir la síntesis de ADN y la producción de proteínas esenciales para el crecimiento del micoplasma, sin dañar las células. Maximiza la recuperación celular y minimiza las pérdidas debido a la contaminación por micoplasma.
Características del producto
Baja toxicidad: Toxicidad mínima para las células, lo que garantiza que no haya interferencias con experimentos celulares posteriores, como ensayos de transfección y viabilidad.
Alta estabilidad: El reactivo puede almacenarse durante mucho tiempo a -20 °C y mantener su alta eficacia.
Fácil de usar: Simplemente agregue el producto al medio de cultivo contaminado con micoplasma e incube.
Acción rápida: 'Resultados inmediatos', con efectos visibles tan pronto como en 3 días.
Amplio espectro: Capaz de eliminar la mayoría de los tipos de micoplasmas encontrados en los laboratorios.
Figura 6.Ilustración de la prueba de citotoxicidad del reactivo de eliminación de micoplasma
Prevención del micoplasma
En el proceso de cultivo celular, a menudo se produce contaminación por micoplasma. Sin embargo, debido a sus características únicas, es difícil detectarlo a simple vista o con un equipo microscópico. Por lo tanto, es particularmente importante hacer un buen trabajo de prevención de micoplasma. Se puede lograr una prevención eficaz de la contaminación por micoplasma añadiendo reactivos de prevención de micoplasma al medio de cultivo.
En la actualidad, el micoplasma en los laboratorios se origina principalmente por: contaminación cruzada entre células, contaminación del entorno de trabajo o del equipo de laboratorio, técnicas asépticas deficientes por parte de los experimentadores, medios de cultivo o reactivos contaminados y tejidos u órganos originales contaminados por micoplasma. La serie de productos para la prevención del micoplasma desarrollados por Yeasen se caracteriza por su simplicidad, comodidad y alta estabilidad, lo que los hace muy adecuados para la prevención del micoplasma en cultivos rutinarios de líneas celulares.
Información del producto
| Producto | Número de catálogo | Nombre del producto | Especificación del producto |
| Kit de pretratamiento de muestra | 18461ES | Kit de preparación de muestras de ADN residual magnético MolPure® | 25 toneladas/100 toneladas |
| 18467ES | Kit de preparación de muestras MolPure® Mag48 FN | 3×16T/ 6×16T | |
| Instrumento de extracción de ácidos nucleicos | 80511ES | Extractor de ácidos nucleicos automatizado de 48 canales | 48 canales |
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Kit de detección de micoplasma | 40619ES | Kit de detección de qPCR en tiempo real de micoplasma MycAway® (2G)
| 25 toneladas/100 toneladas |
| 40612ES | Kit de detección de micoplasma en un solo paso MycAway™ Plus-Color | 25 toneladas/100 toneladas | |
| 40601ES | 10 ensayos/20 ensayos | ||
| Reactivo para la eliminación de micoplasma | 40607ES | Mi cAwayMT. Tratamiento (1000×) - Reactivo para la eliminación de micoplasma | 1 ml/5 × 1 ml
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Reactivo de prevención de micoplasma | 40608ES | Mi cAwayMT. Profiláctico (2000×) - Reactivo de prevención de micoplasma | 1 ml/5 × 1 ml
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| 40605ES | Mi cAwayMT. Spray (listo para usar) | 500 ml/2 x 500 ml/10 x 500 ml
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| 40609ES | MycGuardMT.-1 Solución (100×), para desinfectar el baño de agua de la incubadora de CO2 | 100 ml | |
| 40610ES | MycGuardMT.-2 Solución (500×), para Desinfectar Baños de Agua Ordinarios | 100 ml |