Introducción a la apoptosis
La apoptosis es un fenómeno de muerte celular programada que ocurre durante el desarrollo de una célula o cuando esta se ve afectada por ciertos factores, y se desencadena por la regulación de los genes intracelulares y sus productos. En la vía de la apoptosis, los eventos ocurren en orden cronológico, uno por uno, dando lugar a la presentación de vesículas apoptóticas, y luego ocurre la apoptosis. La apoptosis desempeña un papel crucial en el desarrollo embrionario y la morfogénesis, el mantenimiento de una población estable de células normales en los tejidos, la defensa del cuerpo y las respuestas inmunes, el daño celular causado por enfermedades o intoxicaciones, el envejecimiento y el desarrollo de tumores, y tiene un valor terapéutico potencial.
Principio de detección
La distribución de los fosfolípidos en las membranas celulares normales es asimétrica. La fosfatidilserina (PS) se encuentra en la superficie interna de la membrana celular en las células vivas y, durante la apoptosis, la membrana celular sufre un cambio y la PS se desplaza desde la superficie interna de la membrana celular a la superficie externa de la membrana celular. La anexina V reconoce específicamente la PS en la superficie de las células apoptóticas, mientras que la PS de las células vivas se encuentra en la superficie interna de la membrana celular y no puede unirse específicamente a la anexina V.
El PS de las células necróticas también se desplaza desde la superficie interna de la membrana celular a la superficie externa de la membrana celular, y la anexina V también reconoce el PS en la superficie de las células necróticas, por lo que la anexina V no puede distinguir entre células necróticas y apoptóticas. Por el contrario, el colorante PI pudo unirse al ADN intracelular y distinguir entre células necróticas y células vivas. La membrana celular de las células apoptóticas tempranas y las células vivas todavía está intacta, y el colorante PI no puede pasar libremente a través de la membrana celular para ingresar a la célula y unirse al ADN, por lo que el colorante PI no puede marcar las células apoptóticas y las células vivas, mientras que el colorante PI puede pasar a través de la membrana celular de las células necróticas y unirse al ADN dentro de la célula, y el colorante PI en las células necróticas emitirá fluorescencia roja después de ser excitado por el láser de 488 nm, que será recibido por el canal correspondiente. Por lo tanto, la anexina V y el PI se pueden usar simultáneamente para distinguir entre células vivas, células apoptóticas tempranas y células apoptóticas o necróticas tardías.
Fig. 2 Principio de detección de anexina V/PI
Detección por citometría de flujo
La longitud de onda de excitación máxima de FITC es de 488 nm, la longitud de onda de emisión máxima es de 525 nm y la fluorescencia verde de FITC se detecta en el canal FL1. La longitud de onda de excitación máxima del complejo PI-ADN es de 535 nm, la longitud de onda de emisión máxima es de 615 nm y la fluorescencia roja de PI se detecta en el canal FL2 o FL3. El análisis se realizó con un software como CellQuest y se dibujó un diagrama de dispersión de dos colores con FITC como coordenada horizontal y PI como coordenada vertical. En experimentos típicos, las células se pueden dividir en tres subpoblaciones, con células vivas que tienen solo una fluorescencia de fondo de intensidad muy baja, células apoptóticas tempranas que tienen solo una fluorescencia verde fuerte y células apoptóticas tardías que tienen una tinción doble con fluorescencia verde y roja.
Fig.3 Detección por citometría de flujo
Preguntas frecuentes
P: ¿Se puede aplicar el ensayo de apoptosis de Anexina V a plantas o bacterias (procariotas)?
R: Sí, pero es necesario preparar protoplastos porque las células vegetales o bacterianas (procariotas) contienen paredes celulares. La dosis específica de solución de tinción solo necesita sumergir las células y el tiempo de tinción es algo diferente para las distintas células.
P: ¿Cómo juzgar el resultado del experimento?
A: Las células vivas (Anexina V-/PI-), las células apoptóticas tempranas (Anexina V+/PI-), las células apoptóticas tardías y las células necróticas muestran doble positividad (Anexina V+/PI+), núcleos desnudos (Anexina V-/PI+).
P: ¿Cuál es la diferencia entre Annexin V y TUNEL?
A: El marcaje de extremos cortados mediante la técnica de dUTP (TUNEL) con desoxinucleotidil transferasa terminal es un método de tinción utilizado para identificar sitios de fragmentación de ADN intracelular, una característica distintiva de la apoptosis tardía.
La tinción de anexina V reconoce las primeras etapas de la apoptosis al unirse a los residuos de PS expuestos fuera de la célula debido a la pérdida de asimetría de la membrana celular.
P: ¿Es posible realizar el ensayo utilizando sólo Annexin V-FITC sin detectar PI?
R: Sí, es posible. En el caso de muestras de prueba especiales, como glóbulos rojos sin núcleo, o en el caso de que se utilice el fármaco doxorrubicina (adriamicina), que interfiere con la detección de IP, es posible realizar el ensayo utilizando únicamente Annexin V-FITC en ambos casos.
Detalles del producto
| Nombre del producto | Artículo Nro. | Especificación |
| Kit de detección de apoptosis con anexina V-FITC/7-AAD | 40311ES20/50/60 | 20 toneladas/50 toneladas/100 toneladas |
| 40302ES20/50/60 | 20 toneladas/50 toneladas/100 toneladas | |
| Kit de detección de apoptosis con anexina V-PE/7-AAD | 40310ES20/50/60 | 20 toneladas/50 toneladas/100 toneladas |
| 40303ES20/50/60 | 20 toneladas/50 toneladas/100 toneladas | |
| Kit de detección de apoptosis Annexin V-YSFluor™ 488/7-AAD | 40313ES60 | 100 toneladas |
| 40305ES20/50/60 | 20 toneladas/50 toneladas/100 toneladas | |
| 40304ES20/50/60 | 20 toneladas/50 toneladas/100 toneladas | |
| Kit de detección de apoptosis Annexin V-YSFluor™ 647/7-AAD | 40312ES20/50/60 | 20 toneladas/50 toneladas/100 toneladas |
| 40306ES20/50/60 | 20 toneladas/50 toneladas/100 toneladas | |
| 40307ES20/50/60 | 20 toneladas/50 toneladas/100 toneladas | |
| 40308ES20/50/60 | 20 toneladas/50 toneladas/100 toneladas |