El dDescripción Kit de síntesis de ARN de alto rendimiento T7
El kit de síntesis de ARN de alto rendimiento T7 optimiza el sistema de reacción de transcripción. El kit puede sintetizar el ARN monocatenario de manera eficiente mediante el uso de la ARN polimerasa T7, la yoADN bicatenario inerizado con la secuencia promotora T7 como plantilla, NTP como sustratos para transcribir la secuencia de ADN aguas abajo del promotor. Durante la transcripción, los nucleótidos modificados pueden también se pueden añadir como sustratos para producir biotina o ARN marcado con colorante.
Este kit puede sintetizar ambos Se pueden producir transcripciones largas y cortas de ARN de 100 a 200 μg con 1 μg de ADN de plantilla. El ARN sintetizado por transcripción se puede utilizar para diversas aplicaciones posteriores, como la investigación de la estructura y la función del ARN.yoes, protección de ARNasa, hibridación de sondas, ARNi, microinyección y traducción in vitro.
Principio de síntesis
Figura 1: Proceso de transcripción de ARN in vitro
Ventajas del producto
Alto rendimiento: Puede producir hasta 200 μg en 2 horas mediante reacción de transcripción.
Mejor versatilidad: Adecuado para la transcripción de ARN de 20 nt a 10 000 nt.
Excelente rendimiento: reducir eficazmente los subproductos de la transcripción durante el proceso de IVT
Múltiples aplicaciones: Se puede utilizar para la síntesis de ARN ordinario, marcado y modificado.
Propiedades del producto
Figura 2: Rendimiento de transcripciones de diferentes longitudes
Figura 3: Calidad de las transcripciones de diferentes longitudes
Figura 4: Expresión de transcrito ARNm en HEK-293 células
Nota: El ARNm ha sido protegido con la enzima Vaccinia Capping Enzyme (Yeasen#10614/10615).
Métodos experimentales
Reactivos de descongelaciónCentrifugue brevemente la mezcla de ARN polimerasa T7 y colóquela él en hielo. Descongele el tampón de transcripción 10× y el ribonucleótidos (ATP, CTP, GTP, UTP), mezclar y centrifugar hasta el fondo del tubo, colocar Buffer de transcripción 10× a temperatura ambiente y colocar 4 tipos de ribonucleótidos en hielo.
B.Reacción de transcripción del ensamblaje a temperatura ambientePreparar el sistema de reacción según el siguiente sistema:
| Componentes | Volumen (µL) | Concentración final |
| ARNasa libre H2Oh | Hasta 20 | - |
| 10×Búfer de transcripción | 2 | 1× |
| CTP/GTP/ATP/UTP (100 mM cada uno) | 2 cada uno | 10 mM cada uno |
| Plantilla de ADN | 1 µg | - |
| Mezcla de ARN polimerasa T7 | 2 | - |
Notas:
- La reacción se configura a temperatura ambiente. Dado que el tampón de transcripción 10× contiene espermidina, la alta concentración de espermidina puede provocar la precipitación de la plantilla de ADN a baja temperatura.
Para transcripciones cortas (<100 nt), se puede utilizar una plantilla de 2 µg y extender el tiempo de transcripción a 4-8 h.
3. Para transcripciones largas (>1000 nt), se recomienda utilizar plásmidos linealizados como plantillas para la transcripción.
4. Realice la reacción en el instrumento PCR con la tapa caliente abierta para evitar la evaporación.
5. El producto de reacción puede tener un precipitado blanco. El precipitado es el pirofosfato de magnesio producido por Los iones de pirofosfato y magnesio libres en la solución de reacción no afectan a los experimentos posteriores. Si desea eliminarlos, puede agregar un poco de EDTA. Si la adición de EDTA afecta a los experimentos posteriores, el sobrenadante también se puede recuperar mediante centrifugación.
6. Mantener los reactivos y contenedores libres de contaminación por ARNasa.
Mezclar la solución de los componentes, centrifugar brevemente hasta el fondo del tubo e incubar a 37 °C durante 2 h. Si la longitud de transcripción es inferior a 100 nt, ampliar el tiempo de reacción a 4-8 h.
D. Tratamiento con DNasa I (opcional)Una vez completada la reacción, agregue 2 μL de DNasa I (libre de RNasa) a cada tubo e incube a 37 °C durante 15 minutos para eliminar el ADN molde.
Preguntas frecuentes
- Bajo rendimiento de transcripción
La calidad de la plantilla está estrechamente relacionada con el rendimiento. El rendimiento del grupo experimental es significativamente inferior al del grupo de control. Las posibles razones son:
- La plantilla experimental contiene componentes inhibidores;
- Quizás la plantilla tenga algo mal.
Sugerencias: ① Vuelva a purificar la plantilla; ② Determine la cuantificación de la plantilla y su integridad; ③ Prolongue el tiempo de reacción; ④ Aumente la cantidad de entrada de plantilla; ⑤ Use otros promotores y Otras ARN polimerasas.
- Bajo rendimiento de transcripciones cortas
Los fragmentos cortos de plantilla pueden inhibir la reacción. Cuando el producto de transcripción es inferior a 100 nt, si desea aumentar el rendimiento, extienda el tiempo de reacción a 4-8 h o aumente la cantidad de plantilla a 2 μg.
- La longitud de la transcripción del ARN es Más grande de lo esperado
Si el resultado de la electroforesis muestra que la banda del producto es más grande que el tamaño esperado, las posibles razones pueden ser: ①La plantilla del plásmido puede no estar completamente linealizada; ②El extremo 3' de la cadena sentido tiene una estructura prominente; ③El ARN tiene una estructura secundaria que no está completamente desnaturalizada.
Sugerencias: ①Verifique si la plantilla está completamente linealizada y, si es necesario, realice una linealización adicional; ②Seleccione una enzima de restricción adecuada para evitar salientes 3', o utilice el fragmento Klenow/ADN polimerasa T4 para completar la transcripción antes de continuar; ③Utilice gel desnaturalizado para detectar productos de ARN.
- La longitud de la transcripción del ARN es menor de lo esperado
Si la electroforesis muestra que la banda del producto es más pequeña que el tamaño esperado, las posibles razones son: ①La plantilla contiene una secuencia de terminación similar al terminador de la ARN polimerasa T7; ②El contenido de GC de La plantilla es demasiado alta.
Sugerencias: ①Reducir la temperatura de reacción (por ejemplo, 30 °C). A veces, reducir la temperatura puede contribuir a extender la duración de la transcripción, pero puede Reducir el rendimiento. Pruebe otras Polimerasas de ARN para transcripción; ②Si el contenido de GC de la plantilla es alto, realice la reacción a 42 ℃ o agregue SSB para aumentar el rendimiento y la longitud de la transcripción.
- Cola electroforética de productos transcripcionales
La formación de colas durante la electroforesis puede ser causada por: ① Contaminación por ARNasa durante la operación experimental; ②La plantilla de ADN está contaminada con ARNasas.
Sugerencias: ①Utilice puntas de pipeta y tubos EP libres de ARNasa, use guantes y mascarillas de látex desechables y todos los reactivos estén preparados con H libre de ARNasa.2O. ②Vuelva a purificar el ADN plantilla.
Información de pedidos
| Nombre del producto | Número de catálogo | Sespecificación |
| 10623ES | 50/100/500 toneladas | |
| 10625ES | 10KU/100KU/2500KU/25MU | |
| 10620ES | 10U/100U/1000U | |
| 10621ES | 10 KU/20 KU/100 KU/1 MU | |
| 10614ES | 2KU/10KU/100KU | |
| 10612ES | 10 KU/50 KU/250 KU | |
| 10611ES | 500/2000/10000 U | |
| 12603ES | 24/96 T |