Les mycoplasmes, également connus sous le nom d'organismes de type pleuropneumonie (PPLO), sont les procaryotes les plus petits et les plus simples découverts jusqu'à présent qui ne possèdent pas de paroi cellulaire. Ils ont un diamètre de 0,1 à 0,3 μm, peuvent traverser les filtres et présentent un pléomorphisme élevé. Ce sont des contaminants bactériens relativement courants et difficiles à détecter dans les cultures de cellules de mammifères
La contamination par les mycoplasmes a de multiples effets néfastes sur les cultures cellulaires et est devenue un problème sérieux dans les pratiques de culture cellulaire. On estime que le taux de contamination par les mycoplasmes dans les cultures cellulaires de routine varie de 15 à 35 %, ce qui nuit gravement à la crédibilité des résultats expérimentaux.
Environ 95 % de la contamination par les mycoplasmes dans les cultures cellulaires est principalement causée par Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma arginini, Mycoplasma orale, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma hominis et Mycoplasma hyorhinis. Sur les milieux de culture, les colonies de mycoplasmes forment une sorte d'œuf au plat. Les surnageants et les membranes cellulaires des cultures cellulaires offrent un environnement propice à la croissance des mycoplasmes, et les mycoplasmes qui parasitent la surface des cellules peuvent pénétrer la membrane de la cellule hôte.
Les principales sources de contamination par les mycoplasmes comprennent : les milieux de culture cellulaire ou leurs composants (tels que les matières premières pour le milieu, le sérum et d’autres réactifs), le personnel de laboratoire, les incubateurs de culture cellulaire, les réservoirs de stockage d’azote liquide, les particules en suspension dans l’air et les aérosols, la surutilisation d’antibiotiques, les cultures cellulaires mal scellées et les cellules déjà contaminées par des mycoplasmes.
Parallèlement, les dangers correspondants à ces contaminations comprennent : conduire à la mise au rebut de lots de produits cellulaires ou de produits fabriqués en utilisant des cellules comme milieu en raison de l'incapacité à éliminer efficacement les mycoplasmes pendant la purification en aval ; contaminer tous les équipements et installations connexes, ainsi que les produits intermédiaires ou finaux, qui entrent en contact avec le matériel contaminé ; provoquer la contamination d'autres cellules normales par des mycoplasmes ; entraîner la mise au rebut d'importantes banques de graines cellulaires ou virales en raison d'une contamination par des mycoplasmes ; forcer le laboratoire à arrêter la production ou les opérations expérimentales pour traiter la contamination par les mycoplasmes ; conduire au développement d'une résistance aux mycoplasmes, rendant leur élimination encore plus difficile ; élargir la zone de contamination par les mycoplasmes ; et constituer une menace pour d'autres cultures cellulaires dans le laboratoire.
Par conséquent, des tests et une élimination réguliers des mycoplasmes doivent être effectués pour garantir qu'aucun mycoplasme n'est présent dans le système de culture cellulaire, ce qui est essentiel au déroulement normal de la recherche scientifique.
Mycoplasme Détection
Les mycoplasmes sont un type de contamination relativement courant mais généralement difficile à éliminer. Pour les processus biologiques impliquant la culture cellulaire, la réglementation exige « qu'il n'y ait aucune contamination par les mycoplasmes ».
- L'édition 2020 de la Pharmacopée chinoise, Volume III, « Préparation et contrôle qualité des substrats cellulaires animaux pour la production et les tests de produits biologiques », stipule que pour les cellules utilisées dans la production, des tests de mycoplasmes doivent être effectués sur la banque de cellules principales (MCB), la banque de cellules de travail (WCB) et les cellules de fin de production (EOPC).
- La FDA, Guidance for Industry: Characterization and Qualification of Cell Substrates and Other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines for Infectious Disease Indications, stipule que le contrôle des mycoplasmes doit être effectué sur les matières premières, les semences virales, les fluides de récolte non transformés et d'autres matériaux de ce type.
- L'ICH Q5D, « Dérivation et caractérisation des substrats cellulaires utilisés pour la production de produits biotechnologiques/biologiques », mentionne également que le contrôle des mycoplasmes doit être effectué sur les matières premières, les semences de virus, les fluides de récolte non transformés et d'autres matériaux de ce type.
Figure 1 Points de test de contamination par Mycoplasma requis par les réglementations nationales et internationales
Les méthodes traditionnelles de détection des mycoplasmes comprennent principalement les méthodes de culture et les méthodes de cellules indicatrices. Cependant, en raison des longs cycles de détection ou des problèmes de sensibilité de ces deux méthodes, elles entraînent des cycles de production ou de commercialisation de produits prolongés pour les entreprises. Avec le développement de la thérapie cellulaire et génique, les exigences de l'industrie en matière de rapidité et de sensibilité de la détection des mycoplasmes sont devenues de plus en plus strictes. Les courtes durées de conservation ne suffisent pas à supporter des périodes de détection aussi longues, c'est pourquoi la méthode rapide NAT (Nucleic Acid Testing) s'est distinguée parmi les différentes méthodes de détection des mycoplasmes.
Figure 2 Méthodes de détection des mycoplasmes répertoriées dans les réglementations nationales et internationales
Basé sur les techniques d'amplification des acides nucléiques (NAT), Yeasen a développé une série de kits de détection rapide de mycoplasmes, notamment le kit de détection qPCR en temps réel de Mycoplasma, le kit de détection de mycoplasmes en une étape MycAway™ Plus-Color et le kit de test de mycoplasmes GMyc-PCR.
1.Kit de détection de mycoplasmes par qPCR en temps réelIl s'agit d'un produit destiné à la détection qualitative rapide d'une contamination potentielle par des mycoplasmes dans les matières premières de production, les banques de cellules, les semences virales, les fluides de récolte de virus ou de cellules et les cellules thérapeutiques. Il est principalement utilisé dans les processus de recherche, de développement, de production et de commercialisation de produits biopharmaceutiques.
Qualifications du produit
Conformité réglementaire : Validé selon les exigences des pharmacopées EP2.6.7, JP G3 et USP 63, répondant aux normes des organisations internationales faisant autorité.
Conformité des audits : La production du produit est conforme aux normes du système de gestion de la qualité ISO13485 et est soutenue par une documentation d'audit complète.
Assurance qualité: Toutes les matières premières enzymatiques nécessaires au kit sont autoproduites et ont été industrialisées, garantissant un approvisionnement stable.
Accumulation d'expérience technique : La méthode TaqMan repose sur une base technique solide et la sensibilité du kit peut atteindre 10 UFC/mL et moins.
Focus sur la performance du produit : La bibliothèque d'anticorps enzymatiques Taq, avec des anticorps à double blocage, améliore la spécificité, la sensibilité et la stabilité du kit.
Caractéristiques du produit
Plusieurs types de détection : Les sondes TaqMan optimisées peuvent détecter jusqu'à 183 espèces de mycoplasmes.
Facile à utiliser : Le temps total de préparation et de test des échantillons est inférieur à 3 heures, éliminant ainsi la nécessité d’une attente de 28 jours associée aux méthodes de culture.
Haute sensibilité : La limite de détection est aussi basse que 10 UFC/mL, ce qui en fait une alternative viable aux méthodes de culture directe.
Haute spécificité : Les amorces et les sondes sont conçues pour cibler l'ARNr 16S, garantissant ainsi l'absence de réaction croisée avec des espèces étroitement apparentées telles que les clostridies et les lactobacilles.
Haute sécurité : Le contrôle positif (PC) du kit est non infectieux, éliminant ainsi complètement le risque de contamination.
Forte résistance aux interférences : L'introduction d'un contrôle interne (CI) permet d'exclure les interférences d'échantillons et les anomalies dans la préparation de la réaction, évitant ainsi efficacement les faux négatifs.
Figure 3 Flux de travail pour la détection de Mycoplasma à l'aide du kit de détection qPCR en temps réel de Mycoplasma
2. Kit de détection de mycoplasmes en une étape MycAway™ Plus-ColorIl utilise une technologie d'amplification isotherme unique, offrant une meilleure discrimination des couleurs. Le passage du bleu-violet (négatif) au bleu ciel (positif) est plus facilement perceptible à l'œil nu. De plus, il comprend des composants anti-contamination pour éliminer l'apparition de faux positifs.
Figure 4 : Procédure de fonctionnement pour la détection des mycoplasmes à l'aide du kit de détection des mycoplasmes en une étape MycAway™ Plus-Color
3. GMyc-PCR Mycoplasme DétectionTrousseContrairement aux méthodes de détection PCR classiques en une étape, le nombre d'amorces est augmenté d'une paire à trois paires, ciblant les régions conservées de l'ARNr 16S et 23S des mycoplasmes pour l'amplification par PCR imbriquée. Cela permet non seulement de réduire les produits non spécifiques, mais aussi d'améliorer considérablement la sensibilité du produit, permettant la détection d'une seule copie de mycoplasme.
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Figure 5 Procédure opérationnelle pour la détection des mycoplasmes à l'aide du kit de test GMyc-PCR Mycoplasma
Élimination des mycoplasmes
Dans le processus de culture cellulaire, des tests réguliers peuvent efficacement prévenir une contamination à grande échelle par des mycoplasmes. Cependant, si les cellules sont déjà contaminées par des mycoplasmes, elles doivent être manipulées rapidement. La meilleure pratique consiste à stériliser les cellules contaminées sous haute pression, puis à les jeter pour éviter de contaminer d'autres lignées cellulaires propres. Si les cellules contaminées sont particulièrement précieuses et qu'il est nécessaire d'éliminer la contamination par les mycoplasmes, une combinaison d'antibiotiques peut être utilisée pour atteindre cet objectif. Étant donné que les mycoplasmes n'ont pas de paroi cellulaire, les antibiotiques traditionnels sont généralement inefficaces contre eux. Par conséquent, le choix d'un réactif d'élimination des mycoplasmes approprié est crucial.
Le traitement MycAway™ de Yeasen (1000×) est une préparation antibiotique mixte qui contient trois composants ayant des effets antimicrobiens sur les mycoplasmes : des quinolones, des dérivés de tétracycline et des antibiotiques macrolides. Ce réactif d'élimination des mycoplasmes permet une élimination efficace des mycoplasmes en inhibant la synthèse de l'ADN et la production de protéines essentielles à la croissance des mycoplasmes, sans endommager les cellules. Il maximise la récupération des cellules et minimise les pertes dues à la contamination par les mycoplasmes.
Caractéristiques du produit
Faible toxicité : Toxicité minimale pour les cellules, garantissant aucune interférence avec les expériences cellulaires ultérieures telles que les tests de transfection et de viabilité.
Haute stabilité : Le réactif peut être stocké longtemps à -20°C et conserver sa haute efficacité.
Facile à utiliser : Ajoutez simplement le produit au milieu de culture contaminé par les mycoplasmes et incubez.
Action rapide : « Résultats immédiats », avec des effets visibles dès 3 jours.
Large spectre : Capable d’éliminer la majorité des types de mycoplasmes trouvés dans les laboratoires.
Figure 6.Illustration du test de cytotoxicité du réactif d'élimination des mycoplasmes
Prévention des mycoplasmes
Au cours du processus de culture cellulaire, une contamination par les mycoplasmes se produit souvent. Cependant, en raison de ses caractéristiques uniques, il est difficile de le détecter à l'œil nu ou à l'aide d'un équipement microscopique. Par conséquent, il est particulièrement important de faire un bon travail de prévention des mycoplasmes. Une prévention efficace de la contamination par les mycoplasmes peut être obtenue en ajoutant des réactifs de prévention des mycoplasmes au milieu de culture.
Actuellement, les mycoplasmes présents dans les laboratoires proviennent principalement de : contamination croisée entre cellules, contamination de l'environnement de travail ou du matériel de laboratoire, mauvaises techniques d'asepsie des expérimentateurs, milieux de culture ou réactifs contaminés et tissus ou organes d'origine contaminés par des mycoplasmes. La gamme de produits de prévention des mycoplasmes développée par Yeasen se caractérise par sa simplicité, sa commodité et sa grande stabilité, ce qui la rend particulièrement adaptée à la prévention des mycoplasmes dans les cultures de lignées cellulaires de routine.
Informations sur le produit
| Produit | Numéro de catalogue | Nom du produit | Spécification du produit |
| Kit de prétraitement d'échantillons | 18461ES | Kit de préparation d'échantillons d'ADN résiduel magnétique MolPure® | 25T/100T |
| 18467ES | Kit de préparation d'échantillons MolPure® Mag48 FN | 3×16T/ 6×16T | |
| Instrument d'extraction d'acide nucléique | 80511ES | Extracteur d'acide nucléique automatisé à 48 canaux | 48 canaux |
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Kit de détection de mycoplasmes | 40619ES | Kit de détection de mycoplasmes par qPCR en temps réel MycAway® (2G)
| 25T/100T |
| 40612ES | Kit de détection de mycoplasmes en une étape MycAway™ Plus-Color | 25T/100T | |
| 40601ES | 10 essais/20 essais | ||
| Réactif d'élimination des mycoplasmes | 40607ES | MonAwayMT Traitement (1000×) – Réactif d'élimination des mycoplasmes | 1 ml/5 x 1 ml
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Réactif de prévention des mycoplasmes | 40608ES | MonAwayMT Réactif prophylactique (2000×) - Prévention des mycoplasmes | 1 ml/5 x 1 ml
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| 40605ES | MonAwayMT Spray (prêt à l'emploi) | 500 ml/2 x 500 ml/10 x 500 ml
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| 40609ES | MycGuardMT-1 solution (100×), pour la désinfection du bain-marie de l'incubateur à CO2 | 100 ml | |
| 40610ES | MycGuardMT-2 Solution (500×), pour la désinfection du bain-marie ordinaire | 100 ml |