Der Doppelblock-Anti-TAQ-DNA-Polymerase-Antikörper zur Reduzierung der unspezifischen Amplifikation

Die Molekulardiagnostik ist das am schnellsten wachsende Teilgebiet im Bereich der IVD. Sie bietet die Vorteile einer kurzen Nachweiszeit, einer hohen Sensitivität und einer starken Spezifität. Sie wird häufig in der Tumorbegleitdiagnose und beim Screening von Infektionskrankheiten und genetischen Erkrankungen eingesetzt. Im Bereich der Molekulardiagnostik ist die PCR nicht nur die ausgereifteste Technologieplattform mit dem größten Marktanteil, sondern auch die „Goldstandard“-Technologie der klinischen Diagnostik. Bei der herkömmlichen PCR-Reaktion tritt häufig das Problem der unspezifischen Amplifikation auf. Unspezifische Amplifikation wirkt sich direkt auf die Interpretation der Nachweisergebnisse aus und führt zu einer Verringerung der Amplifikationssensitivität und sogar der Ausbeute an Zielfragmenten. Wie kommt es zu unspezifischer Amplifikation und wie kann sie wirksam vermieden werden?

1. Herkömmliche DNA-Polymerase kann zu unspezifischer Amplifikation führen

2. Hot-Start-Polymerase kann die Amplifikationsspezifität verbessern

3. Double-Block-Taq-Antikörper können Amplifikationsspezifität und Stabilität verdoppeln

4. Leistungsdarstellung von Yeasens Double-Block Taq Antikörper

5. Produktinformationen

1. Konventionelle DNA-Polymerase kann zu unspezifischer Amplifikation führen

Die schlechte Sequenzspezifität von Primern ist die direkte Ursache für unspezifische Amplifikation. Als Promotor der herkömmlichen DNA-Polymerase kann seine Exonukleaseaktivität die DNA-Primersequenz während der Vorbereitung des PCR-Systems verkürzen, um die Spezifität der Primer zu verringern.

Darüber hinaus besitzt herkömmliche DNA-Polymerase nicht nur Exonuklease-Aktivität, sondern auch Polymerase-Aktivität. Obwohl die optimale Verlängerungstemperatur der DNA-Polymerase 72 °C beträgt, ist die Polymerase auch bei Raumtemperatur aktiv. Daher können Primer während der Vorbereitung der PCR-Reaktion und des anfänglichen Erhitzungsprozesses unspezifische Bindungen mit einigen Einzelstrang-Vorlagen bilden und sich unter der Einwirkung der Taq-DNA-Polymerase verlängern, was zur Amplifikation von Nicht-Zielsequenzen führt und die Spezifität der Reaktion beeinträchtigt.

Daher werden PCR-Systeme häufig auf Eis konfiguriert, um die Aktivität der DNA-Polymerase zu hemmen. Obwohl diese Methode einfach und kostengünstig ist, kann sie die Enzymaktivität nicht vollständig hemmen und somit die Amplifikation unspezifischer Produkte nicht verhindern.

2. Hot-Start-Polymerase kann die Amplifikationsspezifität verbessern

Die Hot-Start-Polymerase ist die Kernkomponente der Hot-Start-PCR. Bei Raumtemperatur wird das aktive Zentrum der DNA-Polymerase durch einen Enzymmodifikator blockiert. Erst nach der PCR-Denaturierung bei 95 °C löst sich der Enzymmodifikator auf und die Enzymaktivität wird gestartet, wodurch eine durch das Enzym verursachte unspezifische Amplifikation vermieden wird.

Derzeit umfassen die auf dem Markt gebräuchlichen Hot-Start-Modifizierungsmethoden der DNA-Polymerase hauptsächlich eine chemische Methode, eine Ligandenmethode und eine Antikörpermethode. Unter ihnen ist die Blockierungswirkung der antikörpermodifizierten Hot-Start-Polymerase die beste und die Freisetzungsgeschwindigkeit der Enzymaktivität ist schnell, was die Reaktionszeit der PCR erheblich verkürzen kann. Es handelt sich um eine Hot-Start-Enzymmodifizierungsmethode, die auf dem IVD-Markt weit verbreitet ist.

Es ist jedoch zu beachten, dass die herkömmliche Antikörper-Hot-Start-Methode lediglich die 5‘→3‘-Polymeraseaktivität der Taq-DNA-Polymerase blockiert und dadurch nur eine durch Fehlpaarungen oder Primerdimer verursachte unspezifische Amplifikation bei niedrigen Temperaturen verhindern kann.Wie oben erwähnt, besitzt Taq DNA-Polymerase jedoch nicht nur eine 5'→3'-Polymeraseaktivität, sondern auch eine 5'→3'-Exonukleaseaktivität. Diese Exonukleaseaktivität kann bei niedrigen Temperaturen zum Abbau nicht übereinstimmender Sonden oder anderer Materialien führen, was zu einigen unspezifischen Signalen führt.

3. Double-Block-Taq-Antikörper können Amplifikationsspezifität und Stabilität verdoppeln

Als innovativer Marktführer in der heimischen Molekularenzymindustrie konzentriert sich Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. (im Folgenden Yeasen genannt) auf die Forschung und Entwicklung sowie die Produktion von Rohstoffen für Molekularenzyme und wagt Innovationen. Auf der Grundlage seiner eigenen ausgereiften Antikörper-Screening-Plattform screent es den blockierenden Antikörper mit Taq-DNA-Polymerase als Zielmolekül. Nach Jahren sorgfältiger Forschung und Systemoptimierung hat es entwickelt der Doppelblock-Anti-Taq-DNA-Polymerase-Antikörper, Es kann nicht nur die Polymeraseaktivität der Taq-DNA-Polymerase blockieren, sondern auch die Exonukleaseaktivität der Taq-DNA-Polymerase. In einem zweigleisigen Ansatz kann es nicht nur eine durch Fehlpaarung oder Primerdimer verursachte unspezifische Amplifikation wirksam verhindern, sondern auch eine durch Materialabbau verursachte Erzeugung unspezifischer Signale verhindern und die Stabilität des Reagenzes doppelt verbessern.

4. Leistungsdarstellung von Yeasens Double-Block Taq Antikörper

4.1 Die Verwendung des Double-Block-Taq-Antikörpers ist präziser und sensitiver

Nach Blockierung der Taq-Polymerase mit Yeasens Doppelblock-Antikörper und dem Antikörper der Firma T, die positiven Proben wurden mittels ARMS-PCR nachgewiesen.

Abbildung 1. ARMS-PCR-Amplifikationskurve; Blau: blockierender Antikörper der Firma T; Rot: Yeasens Doppelblock-Antikörper

Aus Abbildung 1 ist ersichtlich, dass die durch den Doppelblock-Antikörper von Yeasen blockierte Taq-Polymerase eine genaue Typisierung und höhere Empfindlichkeit bei der ARMS-PCR-Amplifikation aufweist.

4.2 Der Double-Block-Taq-Antikörper Blockierte die Exonukleaseaktivität der Taq-DNA-Polymerase

Die synthetisierten Primersonden wurden mit der Reaktionslösung der Taq-DNA-Polymerase abgeglichen, die jeweils durch offene und doppelt blockierte Antikörper blockiert war, und bei 40 °C reagiert, um ihre Fluoreszenzsignale zu erkennen.

Abbildung 2. Nachweis der Blockierungseffizienz des Doppelblock-Antikörpers für Exonuklease-Aktivität; Gelb: nicht geschlossene Taq-DNA-Polymerasegruppe; Lila: Taq-DNA-Polymerasegruppe durch Doppelblock-Antikörper blockiert

Aus Abbildung 2 ist ersichtlich dass der Doppelblock-Antikörper die Exonuklease-Aktivität der Taq-DNA-Polymerase wirksam blockieren kann.

4.3 Double-Block-Taq-Antikörper können die Stabilität von Nachweisreagenzien wirksam verbessern

Taq-DNA-Polymerase wurde mit herkömmlichen Blockierungsantikörpern bzw. Doppelblockierungsantikörpern blockiert und in eine vollständige Vormischung mit Primersonde konfiguriert. 10.000 Kopien des ASF-Plasmids wurden 10 Tage lang bei 4 °C oder 1, 3 und 5 Tage lang bei 37 °C amplifiziert. Die Amplifikationskurve und die Änderungen des Ct-Werts wurden beobachtet und die Auswirkungen herkömmlicher Blockierungsantikörper und Doppelblockierungsantikörper auf die Stabilität der vollständigen Vormischungsreaktionslösung wurden verglichen.

Abbildung 3.Amplifikationskurve von 10.000 Kopien des ASF-Plasmids, amplifiziert durch traditionelle Blockierungsantikörper (a) und Doppelblockantikörper (b) in der Blockierungsreaktionslösung; Blau: 10 Tage bei 4 °C lagern; Rot: 0 Tage lang bei 4 °C gelagert (Kontrolle)

Aus Abbildung 3 ist ersichtlich, dass der Doppelblockantikörper die Stabilität der Reaktionslösung aufrechterhalten und die Stabilität des Nachweisreagenzes effektiver verbessern kann als der herkömmliche Blockantikörper. Die Amplifikationskurve und der Ct-Wert änderten sich nicht signifikant, nachdem die gesamte Vormischung mit der Primersonde durch einen Doppelblockantikörper blockiert und 10 Tage lang bei 4 °C aufbewahrt wurde.

Abbildung 4. Amplifikationskurve von 10.000 Kopien des ASF-Plasmids, amplifiziert durch herkömmliche Blockierungsantikörper (a) und Doppelblockantikörper (b) in der Blockierungsreaktionslösung; Blau: 5 Tage bei 37 °C lagern; Grün: 37℃ für 3 Tage; Gelb: 37℃ für 1 Tag; Rot: 0 Tage lang bei 37 °C gelagert (Kontrolle)

Aus Abbildung 4 ist ersichtlich, dass der Doppelblockantikörper die Stabilität der Reaktionslösung aufrechterhalten und die Stabilität des Nachweisreagenzes effektiver verbessern kann als der herkömmliche Blockantikörper. Der Doppelblockantikörper blockiert die gesamte Vormischung, die die Primer-Sonde enthält, und der Unterschied des Ct-Werts beträgt weniger als 0,2, nachdem er 1, 3 und 5 Tage lang bei 37 °C gelagert wurde.

4.4 Double-Block-Taq-Antikörper helfen bei der Lösung des Basisliniendriftproblems

Wenn einige Primer mit einem bestimmten Puffer und bestimmten Instrumenten interagieren, kommt es zu einer Basisliniendrift. Yeasen probierte viele Methoden aus, um das Basislinienproblem zu verbessern, und fand heraus, dass Doppelblock-Antikörper besser zu einer stabilen Basislinie beitrugen.

Abbildung 5. Amplifikationskurve des N-Gens (a) und des ACT-Gens (b); Rot: herkömmlicher blockierender Antikörper; Grün: Doppelblock-Antikörper

Wie aus Abbildung 5 ersichtlich, kann die Verwendung von Doppelblock-Antikörpern unter spezifischen Primern und Puffern dazu beitragen, das Problem der Basisliniendrift zu lösen.

4.5 Eine gute Linearität wurde durch die Verwendung des Double-Block-Taq-Antikörpers erreicht

100.000, 10.000, 1.000 und 100 Kopien von ASF/ACT-Doppelplasmiden wurden mit der durch einen Doppelblock-Antikörper blockierten Reaktionslösung amplifiziert und die Standardkurve erstellt.

Abbildung 6. Standardkurven des ASF-Gens (a) und des ACT-Gens (b), erstellt durch Doppelblock-Reaktionslösung

Wie aus Abbildung 6 ersichtlich, ist die Standardkurve R2 des ASF-Gens beträgt 0,998 und die Amplifikationseffizienz beträgt 98,848 %; Die Standardkurve R2 des ACT-Gens betrug 0,998 und die Amplifikationseffizienz betrug 98,113 %.

4.6 Doppelblock-Taq Antikörper können Enzymaktivität schnell freisetzen

Die Taq-Polymerase wurde mit einem importierten Antikörper der Firma T blockiert und Yeasens Doppelblock-Antikörper (Kat.-Nr. 31303) und die Enzymaktivität wurde nach einem Hitzeschock bei 95 °C für 20 s nachgewiesen. Es ist ersichtlich, dass 31303 nach einem Hitzeschock bei 95 °C für 20 s mehr als 95 % der Enzymaktivität freisetzen kann, was dem Antikörper der Firma T entspricht.

Tabelle 1. Enzymaktivität

4.7 Doppelblock-Taq Antikörper Kann viele Arten von Taq-Enzymen blockieren

Drei Arten von Taq-Enzymen (Wildtyp und 2 Mutanten) wurden durch Yeasens Doppelblock-Antikörper (Kat.-Nr. 31303) blockiert, und das Blockierungsverhältnis betrug 1 μg: 5 U, wobei der Fluoreszenzwert und die Versiegelungseffizienz gemessen wurden. Es ist ersichtlich, dass die Blockierungswirkung von Yeasens Doppelblock-Antikörper (Kat.-Nr. 31303) für verschiedene Arten von Taq-Enzymen besser ist.

Tabelle 2. Blockierungseffizienz verschiedener Taq-Enzymtypen

4.8 Yeasens Double-Block-Taq-Antikörper wies in Mäusen keine genomischen Rückstände auf

Unter Verwendung von Wasser als Vorlage für die Negativkontrolle und des Mausgenoms als Vorlage für die Positivkontrolle wurden 31303 verschiedene Chargen amplifiziert. Es wurde festgestellt, dass das Zielfragment in der Probe nicht amplifiziert wurde, was darauf hinweist, dass der Antikörper keine Mausgenomreste enthielt.

Abbildung 7. Diagramm zur Rückstandserkennung im Mausgenom

Hinweis: - ist die Negativkontrolle, + ist eine Positivkontrolle und 1-5 sind 31303 Proben aus verschiedenen Chargen

5. Produktinformationen