La PCR directa es una reacción que utiliza directamente sangre, tejido animal o vegetal, etc., para la amplificación sin necesidad de realizar pasos de extracción y purificación de ácidos nucleicos. Aporta una comodidad sin precedentes a la amplificación de ADN, lo que puede ahorrar mucho tiempo. Entonces, ¿cuáles son los reactivos y productos que se utilizan en la PCR directa?

1. ¿Qué es la PCR directa?
2. ¿Qué reactivos se necesitan para la PCR directa?
3. Escenarios de aplicación y características del kit PCR directo
4. Datos del producto
5. Comentarios de los clientes
6. Información para pedidos de productos

1. ¿Qué es la PCR directa?

Después de la complementación y mejora continua por parte de innumerables académicos de todo el mundo, la tecnología PCR se ha convertido en el método de investigación básica más utilizado, más frecuentemente utilizado y más importante en todo el campo de las ciencias de la vida. Touch Down PCR, RT-PCR, PCR en tiempo real, PCR múltiple, etc. desarrollados sobre la base de la amplia aplicación de la tecnología PCR tradicional, así como la última PCR digital (PCR digital), han enriquecido enormemente la investigación de la mayoría de los investigadores científicos. Estos métodos han acelerado enormemente el desarrollo de las ciencias de la vida modernas, especialmente la biología molecular, y han hecho grandes contribuciones a la investigación de la vida y la naturaleza para todo el ser humano. La tecnología PCR tradicional y varias tecnologías nuevas y nuevas aplicaciones derivadas de ella tienen un requisito previo, es decir, se deben obtener plantillas de ácidos nucleicos de alta pureza con antelación. Cualquier muestra biológica debe pasar por una serie de procesamientos de muestras complejos y tediosos para obtener muestras de ácidos nucleicos que cumplan con los requisitos técnicos de la PCR. La separación y extracción de ADN y ARN siempre ha sido el trabajo básico que el personal científico y técnico relevante necesita repetir todos los días. Debido a la enorme diferencia entre las muestras, el proceso de separación y extracción de ADN y ARN también es muy diferente. Este trabajo requiere un alto nivel de competencia técnica por parte de los operadores. Debido al uso de algunos reactivos químicos altamente tóxicos en la tecnología tradicional de separación y extracción, la exposición a largo plazo provocará daños irreversibles en el cuerpo del operador e incluso causará daños directos durante el experimento. Los reactivos químicos como el fenol y el cloroformo son carcinógenos importantes en el laboratorio, y el nitrógeno líquido utilizado en el proceso de separación y extracción de ácidos nucleicos de tejidos vegetales plantea una mayor amenaza para la seguridad de los operadores durante el experimento debido a su temperatura ultrabaja. Al mismo tiempo, para quienes tienen una gran cantidad de muestras para estudiar, separar y extraer ácidos nucleicos es una tarea que requiere mucha mano de obra. Ahora los kits de aislamiento y extracción de ácidos nucleicos en el mercado son maduros y hay muchas marcas, pero todos son más o menos iguales. Ya sea un kit de centrífuga de columna de membrana de sílice o un kit de método de perlas magnéticas, se requiere mucho tiempo y el costo es alto. Además del coste del kit, existen requisitos especiales para el equipamiento de laboratorio. La estación de trabajo automatizada que se utiliza en el método de perlas magnéticas es un equipo típico de gran escala y alto valor, que supone un gasto enorme para el laboratorio. En resumen, antes de realizar experimentos de PCR, el pretratamiento de la muestra es un dolor de cabeza inevitable y constante para los investigadores. Cómo resolver este problema y realizar directamente experimentos de PCR sin separación y extracción de ácidos nucleicos siempre ha sido un problema en el que muchos investigadores científicos y personal de laboratorio clínico han estado pensando.

La PCR directa es una reacción en la que se utilizan directamente tejidos animales o vegetales para la amplificación sin extracción de ácidos nucleicos. En muchos sentidos, la PCR directa funciona como la PCR convencional.La principal diferencia es el tampón personalizado que se utiliza en la PCR directa. La muestra se puede someter directamente a la reacción de PCR sin extracción de ácido nucleico, pero existen requisitos correspondientes para la tolerancia de las enzimas involucradas en la reacción de PCR directa y la compatibilidad del tampón. Aunque hay más o menos inhibidores de PCR en las muestras comunes, la PCR directa aún puede lograr una amplificación confiable bajo la acción de enzimas y tampones. Sin embargo, la reacción de PCR tradicional necesita utilizar ácido nucleico de alta calidad como plantilla para la reacción. Si la plantilla contiene proteínas y otras impurezas, inhibirá el progreso suave de la reacción de PCR.

El campo de aplicación más antiguo de la PCR directa es el campo de los animales y las plantas, como la sangre, el tejido y el pelo de ratones, gatos, pollos, conejos, ovejas, ganado vacuno y otros animales; hojas y semillas de plantas, etc. Se utiliza para estudiar la genotipificación, la transgenia, la detección de plásmidos, el análisis de eliminación de genes, la identificación de fuentes de ADN, la identificación de especies, el análisis de SNP y otros campos. Estos campos tienen algunas características comunes, es decir, el contenido del gen diana es relativamente alto y la extracción de ácidos nucleicos es problemática. Por lo tanto, la PCR directa no solo puede ahorrar tiempo y tener poco impacto en los resultados, sino que también ahorra costos.

2. ¿Qué reactivos se necesitan para la PCR directa?

2.1 Muestra de lisado

El lisado de muestra puede prepararse por uno mismo o comprarse. La diferencia en los componentes de las distintas marcas de lisado hará que la capacidad de lisis sea diferente y, por lo tanto, el tiempo de lisis será ligeramente diferente. Por ejemplo, para la preparación de muestras de tejido animal, generalmente se recomienda realizar la lisis durante 30 minutos o durante la noche, y el lisado para virus varía de 3 a 10 minutos.

2.2 Mezcla maestra de PCR

Se recomienda utilizar una ADN polimerasa de arranque en caliente para mejorar la amplificación específica y una mayor capacidad de amplificación. En el corazón de la PCR directa se encuentra una polimerasa altamente resistente.

2.3 Eliminar o inhibir componentes en muestras que afecten la amplificación del ADN

Una vez que la muestra es procesada por el lisado, se liberan proteínas, lípidos y otros restos celulares, y estas sustancias inhiben la reacción de PCR. Por lo tanto, la PCR directa necesita agregar los inhibidores o eliminadores correspondientes para reducir la influencia de estos factores.

3. Escenarios de aplicación y características del kit PCR directo

El kit de PCR directa de Yeasen puede amplificar directamente las muestras de plantas, tejido animal o sangre, y otras muestras originales sin purificación de ácidos nucleicos, lo que simplifica enormemente el proceso experimental de PCR. La genotipificación basada en PCR (Figura 1) se realizó utilizando la muestra original sin purificación del genoma (Figura 1A) o utilizando su lisado (Figura 1B) como plantilla. En comparación con la genotipificación basada en PCR general, el kit de PCR directa tiene un menor consumo de muestra, una operación sencilla, un bajo costo experimental y una detección de muestra cuantitativa de alta calidad.

Figura 1. Tecnología de PCR directa.

A. Método directo: tome una pequeña cantidad de muestras y agréguelas directamente a la mezcla de PCR para la identificación por PCR. B. Método de lisis: agregue la muestra a la solución de lisis para liberar el genoma y agregue una pequeña cantidad del sobrenadante de lisis a la mezcla de PCR para la identificación por PCR.

3.1 Aplicaciones

Detección de amplificación de genes animales, genotipado de animales transgénicos, identificación de plantas transgénicas, genotipado de plantas, etc.

3.2 Características

★   Directo: sin purificación de ADN;
★   Rápido: 10 minutos para completar la preparación de la plantilla, 50 minutos para completar la reacción de PCR;
★   Simple: las muestras se pueden lisar sin cizallar ni moler;
PCR Mix se presenta en forma de mezcla maestra, lo que reduce los pasos de adición de muestra.
★   Ahorro: menor consumo de material
★   Alto rendimiento: la reacción de lisis se puede completar en una placa de 96 pocillos.
★   Fuerte tolerancia a los inhibidores

4. Datos del producto

4.1 Tipo universal multianimal: Kit de PCR directa de tejido animal

4.1.1 Más rápido: acorta el tiempo de operación

Figura 2. Un kit de PCR directa de tejido animal de Yeasen podría ahorrar más tiempo.

4.1.2 Ejemplo: Identificación del genotipo de ratones knockout

Figura 3. Resultados de la amplificación directa de tejido animal con el kit de PCR directa para la detección de animales con genes knock out.

M: escalera de ADN de 100 pb. Carriles 1-8: lisado como plantilla. +: 50 ng de ADN genómico purificado como plantilla. ﹣: agua desionizada como plantilla. Varios ciclos: 35 ciclos. Fragmento único (580 pb): genoma homocigoto de animal knockout. Fragmento único (180 pb): genoma de tipo salvaje. Dos fragmentos (580 pb/180 pb): genoma heterocigoto de animal knockout.

4.2 Específico para roedores: Kit de PCR directa de tejido de ratón

4.2.1 Más rápido: liberación suficiente de genes

Figura 4 Resultados de amplificación directa del kit de PCR directa de tejido de ratón con diferentes tiempos de lisis.

M: escalera de ADN de 100 pb. +: 50 ng de ADN genómico purificado como plantilla. Varios ciclos: 35 ciclos.

4.2.2 Mejor que el método general de lisis alcalina

Figura 5. Resultados de la amplificación del gen SOX21 de la cola de ratón tratada con diferentes métodos de lisis.

M: escalera de ADN de 100 pb. Carriles 1-2: lisado como plantilla mediante lisis alcalina general. Carriles 3-4: lisado como plantilla mediante kit de PCR directa de tejido de ratón. +: 50 ng de ADN genómico purificado como plantilla. -: agua desionizada como plantilla. Varios ciclos: 35 ciclos.

4.2.3 Comparar con productos similares

Figura 6. Resultados de la amplificación del gen SOX21 de la cola de ratón tratada con productos similares de diferentes marcas.

M: escalera de ADN de 100 pb. +: 50 ng de ADN genómico purificado como plantilla. Varios ciclos: 35 ciclos.

4.3 Kit de PCR directa de tejido vegetal

4.3.1 Verificación de muestras de plantas de múltiples tipos

Figura 7. Resultados de la amplificación directa de hojas de diferentes plantas.

M: Escalera de ADN de 100 pb. C: El ADN genómico purificado como plantilla.Carriles 1 y 2: el tejido de la hoja se lisa como plantilla. Varios ciclos: 30 ciclos.

5. Comentarios de los clientes

5.1 Genotipado de ratones

Figura 8. Resultados de la identificación del genotipo del ratón utilizando el kit de PCR directa de tejido de ratón por parte de los usuarios de Beijing Jishi Life Technology Co., Ltd.

5.2 PCR directa del arroz

Figura 9. Amplificación de genes relacionados con el arroz utilizando kits de PCR directa de tejido vegetal por usuarios de la Universidad Agrícola de Huazhong.

6. Información para pedidos de productos

Yeasen es una empresa de biotecnología dedicada a la investigación, desarrollo, producción y venta de tres reactivos biológicos principales: moléculas, proteínas y células. Los productos que ofrece Yeasen son los siguientes.

Tabla 1. Información para pedidos de productos